于 洋 , 王建華 , 方圣濤 姜作真, 周曉群, 夏傳海

(1. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學與生物資源利用所重點實驗室 山東 煙臺 264003; 2. 煙臺水產(chǎn)研究所, 山東 煙臺 264000; 3. 中國科學院 海洋環(huán)境腐蝕與生物污損重點實驗室, 山東 青島266071; 4. 中國科學院大學, 北京 100049)

海洋生物污損是指包括海洋動物(如紫貽貝、藤壺等), 海洋植物(如石莼等), 以及海洋微生物(如細菌、硅藻等)在浸水人工設(shè)施表面的附著、生長和繁殖[1]。生物污損的形成過程分為如下幾個步驟: 首先是有機顆粒在浸水設(shè)施表面上附著形成條件膜; 然后是污損細菌和硅藻等微型污損生物的黏附, 在條件膜表面形成生物膜; 隨后其他污損生物如藻類孢子及大型污損動物的幼蟲進一步在生物膜的表面進行黏附并發(fā)育生長, 形成復(fù)雜的大型生物污損層,這給海水養(yǎng)殖業(yè)、海上運輸業(yè)、海上采油等帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]。近年來, 隨著人類海事活動的增加, 生物污損的形成機制及其新型的防除方法探索逐漸成為海洋領(lǐng)域的研究熱點。

生物污損可以分為微型污損和大型污損, 微型污損是指污損細菌及硅藻等形成的污損生物膜, 改變了設(shè)施表面潤濕度、微觀形貌等物理化學特征, 影響著大型污損過程, 即大型藻類和污損動物的進一步附著和生長[3]。污損生物膜的形成是大型污損層形成的基礎(chǔ), 為后續(xù)污損的發(fā)生提供了立足點, 因此,污損生物膜被認為是揭示生物污損形成機制和研究開發(fā)新型防污劑的重要突破點。

污損生物膜是由污損細菌、硅藻及其分泌的胞外聚合物組成, 鞭毛蟲、纖毛蟲等占不到 1%, 具有完整、復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)[4]。在海洋環(huán)境中, 細菌構(gòu)成了生物膜的主要組成部分, 研究表明, 污損生物膜細菌群落結(jié)構(gòu)及其次級代謝產(chǎn)物能夠影響后續(xù)污損的形成[5]。例如, 王沖等[6]研究發(fā)現(xiàn), 細菌生物膜可以促進厚殼貽貝幼蟲的附著和發(fā)育, 促進作用隨生物膜干重、細菌密度等的增加而增強。對藤壺幼蟲的附著現(xiàn)象研究表明, 不同菌落組成的生物膜樣品均可以促進藤壺幼蟲的附著, 但幼蟲傾向于附著于潮間帶生物膜上, 表明生物膜菌落組成存在時空差異, 而不同細菌組成的生物膜對藤壺孢子的附著存在一定影響[7]。Campbell等[8]研究了細菌群落組成與巨蠣幼蟲附著的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)細菌生物膜可以促進幼蟲附著, 促進作用隨生物膜生物量的增加而增強,而且幼蟲附著率與細菌生物膜群落組成相關(guān)。Dahms等[9]制備了菌落組成不同、活性不同、細菌密度不同的生物膜, 并用以研究華美盤管蟲幼蟲附著, 發(fā)現(xiàn)附著率存在明顯差異。二者均提出污損細菌群落差異造成的對后續(xù)污損效應(yīng)的不同, 可能是由細菌代謝物引起。Harder等[10]對生物膜細菌發(fā)酵上清液的研究證實, 污損細菌產(chǎn)生的某些物質(zhì)能夠促進華美盤管蟲的附著生長。因此, 研究污損細菌群落結(jié)構(gòu)及其代謝物, 是探究生物污損形成機制和開發(fā)新型抗污劑的重要方向。

本文是針對污損細菌組成的污損微生物膜展開研究工作的, 對煙臺海域?qū)嵉貟彀迦〉玫奈⑸锬ぜ毦郝浣Y(jié)構(gòu)進行了分析, 并對其發(fā)酵液中的化學成分進行了分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定, 從中發(fā)現(xiàn)了多種DKP類化合物及其他種類的代謝物, 為探究污損生物膜的形成和作用機制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及其培養(yǎng)

污損微生物膜為2011年11月煙臺海域海上掛板實驗所得, 取樣地點為 37°30′48.45′ N, 121°26′41.37′ E,掛板時間為 6 d, 所用板材為聚氯乙烯(poly vinyl chloride, PVC)板。

發(fā)酵培養(yǎng): 用棉簽將板材表面微生物膜刮至液體培養(yǎng)基中備用。取適量菌體接種于滅菌后的培養(yǎng)基中, 30 ℃, 120 r/min 搖床培養(yǎng)12 h。選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌[11], 培養(yǎng)基均為海水配制, 121℃滅菌20 min后使用。共發(fā)酵20 L。

1.2 菌種鑒定

采用 CTAB-SDS法提取污損微生物膜細菌總DNA[12]。經(jīng)過454 Roche GS-FLX高通量測序確定微生物膜樣品中的細菌種類[13]。

1.3 代謝產(chǎn)物的分離純化

發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min, 取上清液, 分別用乙酸乙酯和正丁醇萃取4次, 減壓濃縮至干, 得到粗提物[14]。粗提物經(jīng)硅膠柱層析分離, 以二氯甲烷/甲醇不同比例混合液為洗脫劑, 按照30∶1 (600 mL)、20∶1 (400 mL)、10∶1 (400 mL)、5∶1 (400 mL)梯度進行洗脫, 得到 8個組分。其中組分 A經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析, 以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫得到化合物(9)(122 mg)。組分B經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析, 以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫得到化合物(8) (22 mg)。組分C經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析, 以石油醚/丙酮梯度洗脫得到化合物(1)(17 mg), 化合物(2) (16 mg); 剩余部分經(jīng)二氯甲烷/甲醇梯度洗脫得到化合物(7)(3 mg)。組分D經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析, 以石油醚/丙酮梯度洗脫得到化合物(4) (127 mg)。組分E經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析及反相硅膠柱層析得到化合物(3)(98 mg); 剩余部分經(jīng)二氯甲烷/甲醇=1∶1凝膠柱層析得到化合物(6)(8 mg)。組分 F經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析, 以二氯甲烷/甲醇梯度洗脫得到化合物(5)(200 mg)。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

儀器: Bruker AVANCE III 500型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞士 Bruker公司)。將所得化合物溶解于氘代試劑中, 進行核磁共振掃描(1H NMR為 500MHz,13C NMR為125MHz)。記錄1H NMR、13C NMR、DEPT90、DEPT135等譜圖信息。

2 結(jié)構(gòu)與分析

2.1 污損微生物膜細菌組成

高通量測序結(jié)果表明, 該批微生物膜樣品中共含有如下幾種細菌: 假交替單胞菌(Pseudoalteromonas sp.), 芽孢桿菌(Bacillus sp.), 鹽單胞菌(Halomonas sp.), 嗜冷桿菌(Psychrobacter sp.), 腸桿菌(Enterobacter sp.)。從芽孢桿菌屬共鑒定得到海水芽孢桿菌(Bacillus aquimaris), 抱川芽孢桿菌(Bacillus pocheeonensis), 產(chǎn)氮芽孢桿菌(Bacillus azotoformans), 越南芽孢桿菌(Bacillus vietnamensis)。從假交替單胞菌屬共鑒定得到依氏假交替單胞菌(Pseudoalteromonas issachenkonii), 河豚毒素假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas tetraodonis), 別樣假交替單胞菌(Pseudoalteromonas aliena), 普里茲灣假交替單胞菌(Pseudoalteromonas prydzensis), 海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas marina)。測序結(jié)果中芽孢桿菌占 67.9%, 假交替單胞菌占20.8%, 是生物膜中的優(yōu)勢菌。

2.2 次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物(1): C7H10N2O2, 白色固體。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 6.59 (1H, s, NH-8), 4.09 (1H, m,H-6), 3.92 (2H, m, H-9), 3.59 (2H, m, H-3), 2.40 (2H,m, H-5), 1.94 (2H, m, H-4).13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 169.7 (C-1, C=O), 163.4 (C-2, C=O), 58.5(C-6), 46.6 (C-9), 45.3 (C-3), 28.4 (C-5), 22.4 (C-4)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[15], 基本一致, 化合物(1)被鑒定為環(huán)(脯氨酸-甘氨酸)。

化合物(2): C8H12N2O2, 淡黃色固體。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 6.63 (1H, s, NH-8), 4.22 (1H, m,H-6), 4.06 (1H, m, H-9), 3.45 (2H, m, H-3), 2.79 (2H,m, H-5), 1.94 (2H, m, H-4), 1.49 (3H, d, J = 6.8 Hz,H-10)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 169.6 (C-1,C=O), 165.2 (C-7, C=O), 59.1 (C-6), 56.3 (C-9), 45.3(C-3), 28.1 (C-5), 22.7 (C-4), 15.9 (C-10)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[16], 基本一致, 化合物(2)被鑒定為環(huán)(脯氨酸-丙氨酸)。

化合物(3): C11H18N2O3, 淡黃色油狀液體。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δH: 6.10 (1H, s, NH-8), 4.51(1H, m, H-6), 4.08 (1H, m, H-9), 3.71 (1H, m, H-4),3.57 (2H, m, H-3), 2.40 (2H, m, H-5), 1.79 (2H, m,H-10), 1.52 (1H, m, H-11), 1.01～1.02 (6H, m, H-12,13)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 170.4 (C-1,C=O), 166.2 (C-7, C=O), 68.5 (C-4), 57.4 (C-6), 54.3(C-3), 53.4 (C-9), 38.5 (C-5), 37.4 (C-10), 24.7 (C-11),23.2 (C-12), 21.2 (C-13)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[17],基本一致, 化合物(3)被鑒定為環(huán)(4-羥基-脯氨酸-亮氨酸)。

化合物(4): C14H16N2O3, 淡黃色固體。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 7.06 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2′,6′), 6.81 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3′, 5′), 6.63 (1H, s,NH-8), 4.12 (1H, m, H-6), 4.09 (1H, m, H-9), 3.56 (2H,m, H-3), 3.45 (2H, m, H-10), 2.35 (2H, m, H-5), 1.92(2H, m, H-4)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 170.5(C-1, C=O), 166.4 (C-7, C=O), 155.9 (C-4′), 130.3(C-3′, 5′), 126.8 (C-1′), 116.0 (C-2′, 6′), 59.1 (C-6),51.2 (C-9), 45.4 (C-3), 36.0 (C-10), 28.3 (C-5), 22.4(C-4)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[18], 基本一致, 化合物(4)被鑒定為環(huán)(脯氨酸-酪氨酸)。

化合物(5): C4H4N2O2, 白色固體。1H NMR(DMSO-d6,500MHz) δH: 11.00 (1H, s, NH-1), 10.81(1H, s, NH-3), 7.39 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 5.44 (1H,d, J = 7.6 Hz, H-5)。13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δC:164.7 (C-14, C=O), 151.9 (C-7, C=O), 142.6 (C-5),110.6(C-6). 核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[19], 基本一致,化合物(5)被鑒定為尿嘧啶。

化合物(6): C5H6N2O2, 白色固體。1H NMR(DMSO-d6,500MHz) δH: 10.97 (1H, s, NH-1), 10.58(1H, s, NH-3), 7.24 (1H, s, H-6), 1.76 (3H, s, H-7)。13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δC: 165.3 (C-4, C=O),151.9 (C-2, C=O), 138.1 (C-6), 108.1 (C-5), 12.2(C-7)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[20], 基本一致, 化合物(6)被鑒定為胸腺嘧啶。

化合物(7): C8H10O2, 白色固體。1H NMR (CDCl3,500 MHz) δH: 7.11 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2, 6), 6.81(2H,d, J = 8.5 Hz, H-3, 5), 3.83 (2H, t, J = 6.6 Hz, H-8),2.81 (2H, t, J = 6.5 Hz, H-7)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 154.2 (C-4), 130.5 (C-1), 130.1 (C-2), 115.4(C-3), 63.8 (C-7), 38.2 (C-8)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[21],基本一致, 化合物(7)被鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物(8): C5H30O2, 淡黃色油狀。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 2.36 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2),1.65 (2H, m, H-3), 1.22～1.42 (22H, m, H-4～14), 0.90(3H, m, H-15)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 179.80(C=O), 34.21 (C-2), 32.15 (C-3), 29.89 (C-4), 29.69(C-5), 29.66 (C-6), 29.62 (C-7), 29.58 (C-8), 29.46(C-9), 29.36 (C-10), 29.29 (C-11), 29.21 (C-12), 24.9(C-13), 22.9 (C-14), 14.2 (C-15)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[22], 基本一致, 化合物(8)被鑒定為十五烷酸。

化合物(9): C24H38O4, 無色透明油狀。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 7.72 (2H, m, H-2, 5), 7.53 (2H,m, H-3, 4), 4.24 (4H, m, H-1′, 1″), 1.72 (2H, m, H-2′,2″), 1.27～1.51 (16H, m, H-3′, 4′, 5′, 7′, 3″, 4″, 5″, 7″),0.96 (6H, m, H-6′, 6″), 0.94 (6H, m, H-8′, 8″)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 167.9 (2 x C=O), 132.6(C-1, 6), 131.0 (C-3, 4), 129.0 (C-2, 5), 68.3 (C-1′, 1″),38.9 (C-2′, 2″), 30.5 (C-3′, 3″), 29.1 (C-4′, 4″), 23.9(C-7′, 7″), 23.1 (C-5′, 5″), 14.2 (C-6′, 6″), 11.1 (C-8′,8″)。核磁數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻對照[23], 基本一致, 化合物(9)被鑒定鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯。文獻報道該化合物為常見塑化劑, 可能為實驗過程中塑料制品帶來的雜質(zhì), 雖然有報道稱其為微生物次級代謝產(chǎn)物,但其真實來源有待于進一步考證。

化合物(1) ～ (9)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

3 結(jié)果與討論

生物污損給人類海事活動帶來了許多困擾, 有效環(huán)保地防御生物污損是人類面臨的巨大挑戰(zhàn)。探究污損微生物膜細菌的次級代謝產(chǎn)物, 是生物污損發(fā)生發(fā)展機制的基礎(chǔ)性研究, 有利于揭示污損微生物膜的作用機制, 從而為生物污損的防除奠定理論及物質(zhì)基礎(chǔ)。信號分子作為污損生物膜細菌的一類次級代謝產(chǎn)物, 同時是微生物群體感應(yīng)的媒介, 在調(diào)控生物膜形成過程起著重要的作用[24]。其中DKP是一類環(huán)二肽衍生物, 研究表明一些 DKP可以影響生物膜的形成, 并且對某些細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)具有猝滅作用。例如 DKP在 Pseudomonas aeruginosa中能夠誘導(dǎo)群體感應(yīng)發(fā)生, 進而影響該菌生物膜的形成; DKP能有效抑制Streptococcus liquefyaciens的群體感應(yīng)系統(tǒng)的運行[25]。Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)從海洋細菌Streptomyces fungicidicus中分離得到的DKP能顯著抑制藤壺的附著, 具有良好的防污性能,表明這類物質(zhì)也有可能作為防污劑來進行開發(fā)和使用。

圖1 化合物(1)～(9)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of chemicals (1)～(9)

本研究以污損微生物膜細菌為研究對象, 對煙臺海域污損微生物膜細菌組成進行了調(diào)查研究, 并從污損微生物膜細菌發(fā)酵液中分離得到了 9種細菌次級代謝產(chǎn)物, 其中化合物(1)～(4)為 DKP類信號分子, 作為微生物產(chǎn)生的常見信號分子, 其在細菌群體感應(yīng)中可能起到調(diào)控作用; 化合物(5)和化合物(6)為DNA的主要構(gòu)成部分之一, 含氮堿基在生物遺傳信息的合成過程中起到重要作用, 這些化合物在微生物膜的形成和發(fā)展過程中的作用機制及其信號物作用有待于進一步考證。微生物膜作為浸水設(shè)施表面最初的附著生物群體, 影響著后續(xù)污損的形成,因此, 了解微生物膜的發(fā)生和發(fā)展過程是選擇新型防污劑和防污技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。通過在實驗室培養(yǎng)條件下對污損微生物膜細菌代謝物進行分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定, 本研究發(fā)現(xiàn)污損微生物膜細菌可以產(chǎn)生DKP類信號分子, 為探究信號分子在污損微生物膜形成中的作用提供了理論依據(jù), 并為生物污損形成機制研究和新型抗污劑的開發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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