劉曉玲，郭紅月，董 猛，宋振川

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北滄州061001)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)，也是唯一能將抗原遞呈給初始T細(xì)胞激發(fā)初次免疫應(yīng)答的抗原呈提細(xì)胞，被認(rèn)為是機(jī)體免疫的始動者，在抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著重要作用，基于DC的免疫治療被認(rèn)為是最具前景的抗腫瘤治療［1］，本研究采用簡便方法體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增小鼠骨髓DCs，為抗腫瘤疫苗的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

SPF級615小鼠，雌雄各半，鼠齡6～8周齡，體重17～21g，購于天津中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBICO公司)、PBS粉(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)rmIl-4、rmGMCSF、rmTNF-α、FITC 標(biāo)記抗鼠單克隆抗體、PE 標(biāo)記抗鼠CD86單克隆抗體均購于美國BioLegend公司。CO2培養(yǎng)箱(美國 SHELDON)、流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 小鼠骨髓單核細(xì)胞分離 將615小鼠拉頸處死，浸入75%酒精消毒5min，無菌狀態(tài)下取脛骨和股骨，剪掉股骨和脛骨骨兩端，用1ml一次性使用注射器抽取PBS液，刺入骨髓腔反復(fù)沖洗，骨髓細(xì)胞懸液過400目濾網(wǎng)去除組織碎片，收集細(xì)胞懸液離心(1 500r/min，5min)，棄上清，以1∶10體積比加入37℃預(yù)溫的紅細(xì)胞裂解液重懸使紅細(xì)胞裂解，同法PBS液離心清洗2次。

1．2．2 骨髓源樹突狀細(xì)胞(BMDC)的培養(yǎng)擴(kuò)增用全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以RMPI-1640全培養(yǎng)液配成2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔中加入完全培養(yǎng)基至4ml，再加入GM-CSF(終質(zhì)量濃度20ng/ml)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。第3天輕輕吹打，吸去培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞加入新鮮的等量RMPI-1640全培養(yǎng)液和相同濃度的GM-CSF及終濃度為10ng/ml的IL-4，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日半量換液，補(bǔ)充RMPI-1640全培養(yǎng)液和GM-CSF及IL-4。繼續(xù)培養(yǎng)至第8天，加入TNF-α(10ng/ml)，孵育48小時(shí)收集懸浮細(xì)胞即為成熟的DCs。

1．2．3 細(xì)胞生長狀態(tài)觀察 每天相差顯微鏡下觀察DC的形態(tài)、數(shù)量、分布、貼壁情況、細(xì)胞集落生長情況并拍照。

1．2．4 DC細(xì)胞表型流式細(xì)胞術(shù)分析 分別收集加入TNF-α前及加入TNF-α 48小時(shí)后的DC懸液，離心沉淀(1 000r/min，5min)，去上清，加PBS 4ml懸垂，再離心2次，用PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×106個(gè)/ml，加入 Eppendorf管，每管 100μl，然后分別加入 FITC anti-mouseCD11c、Peanti-mouseCD86單抗各2μg，4℃避光孵育30min，PBS液洗3次后用，流式細(xì)胞儀檢測各組DC表面CD11c、CD86的表達(dá)情況，將加入TNF-α前后組作為實(shí)驗(yàn)組，未加入抗體的DC組作為對照組，比較其表面標(biāo)志物的表達(dá)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，DC表型表達(dá)陽性率數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以 P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)分離提純的小鼠骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后相差顯微鏡下可見培養(yǎng)板底部有半貼壁細(xì)胞，少量細(xì)胞集落形成，簇狀生長，細(xì)胞體積小，圓形，細(xì)胞無明顯突起(圖1a);體外培養(yǎng)3天后可見貼壁細(xì)胞逐漸增多，松散粘附于培養(yǎng)板的細(xì)胞集落增多，散在少量DC，半貼壁，細(xì)胞體積有所增大，細(xì)胞核可見，為較小圓或橢圓形，可見貼壁的單核巨噬細(xì)胞(圖1b);第5天可見部分細(xì)胞脫壁，從細(xì)胞集落中釋放出來，呈半貼壁狀態(tài)，細(xì)胞體積變大，形態(tài)不規(guī)則，有部分突起，即為未成熟DC(圖1c～圖1e);培養(yǎng)第7天，細(xì)胞體積更大，培養(yǎng)液中有更多懸浮細(xì)胞，細(xì)胞集落散在其中，更加松散，形態(tài)趨于特征性星形，有2～5個(gè)不等的突起，懸浮細(xì)胞為擴(kuò)增之骨髓樹突狀細(xì)胞(圖1f～1g);加入TNF-α 24h后，大量形態(tài)典型的DC從集落釋放，細(xì)胞生長旺盛，體積增大，有明顯樹枝狀突起，突起粗大且長，胞體飽滿，呈星形、多邊形、或梭行(圖1h～1j)。每只615小鼠平均能分離出3×107個(gè)骨髓細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可獲得7×106個(gè)DC。

圖1 DC培養(yǎng)觀察圖

2．2 流式細(xì)胞儀檢測小鼠骨髓DC加入TNF-α前后CD11c及CD86的陽性表達(dá)情況

將加入TNF-α前后組作為實(shí)驗(yàn)組，將未加抗體的DC作為對照組，結(jié)果顯示，CD11c陽性表達(dá)率加入 TNF-α 前為:(65．09 ±3．04)%(圖 2)，加入TNF-α后為:(70．99 ± 1．44)%(圖 3)(χ2=6．625;p=0．097);CD86陽性表達(dá)率加入 TNF-α 前為(25．80±0．30)%(圖 2)，加入 TNF-α 后為(55．91 ±2．41)%(圖 3)(χ2=6．856;p=0．032)。CD86 加入TNF-α前陽性表達(dá)率低于加入TNF-α后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD11c的陽性表達(dá)率加入TNF-α前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0．05)。見表1。

圖2 加入TNF-α前CD11c、CD86陽性表達(dá)率

圖3 加入TNF-α后CD11c、CD86陽性表達(dá)率

表1 流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞CD11c CD86陽性表達(dá)率 ［(±s)%］

表1 流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞CD11c CD86陽性表達(dá)率 ［(±s)%］

◆組與* 組比較，P ＞0．05(χ2=6．625;p=0．097)▲組與★組比較，P ＜0．05(χ2=6．856;p=0．032)

表面標(biāo)志物 加入TNF-α前 加入TNF-α后CD11c 65．09 ±3．04◆ 70．99 ±1．44*CD86 25．80 ±0．30▲ 55．91 ±2．41★

3 討論

樹突狀細(xì)胞是由Steinman和Cohn首先由小鼠脾臟組織中分離發(fā)現(xiàn)的，因其具有典型的樹突狀突起而命名［2］。在接受抗原刺激成熟后，DC可以有效地?cái)z取抗原，并通過抗原肽/MHC分子復(fù)合物的形式，將抗原有效提呈給初始T細(xì)胞，刺激生成針對該抗原的特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞，從而有效啟動機(jī)體免疫反應(yīng)［3］。目前，已能夠通過體外抗原沖擊、基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合等方法制備出相應(yīng)的DCs腫瘤疫苗，并且在動物實(shí)驗(yàn)中獲得很好的效果［4-6］。

DC主要來源于骨髓的CD34+造血干細(xì)胞，故可以從骨髓細(xì)胞中分離誘導(dǎo)DC，獲得一定量有功能的DC是深入研究其生物學(xué)功能的關(guān)鍵，然而DC在體內(nèi)分布分散，含量極低，在動物和人外周血中尚不足白細(xì)胞總量的1%，在實(shí)質(zhì)器官中低于局部細(xì)胞1%，在血液中低于有核細(xì)胞的0．1%，故如何體外大量擴(kuò)增DCs成為研究者目前急需解決的問題［7］。

在小鼠DC的體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增中添加細(xì)胞因子是最重要的環(huán)節(jié)，GM-CSF是維持DC發(fā)育及分化最根本的細(xì)胞因子，但是單一使用GM-CSF只能產(chǎn)生少量的DC集落，并且還會刺激骨髓細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞大量增殖，影響DC純度，而IL-4能抑制培養(yǎng)物中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，并能使DC具有典型形態(tài)和很強(qiáng)的處理外源性抗原能力［8］。通過聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF和IL-4進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7天時(shí)，加入脂多糖(LPS)繼續(xù)培養(yǎng)24h，能獲得大量成熟 DCs［9］。

在本研究開始，GM-CSF及IL-4濃度配比較低，骨髓細(xì)胞生長緩慢，調(diào)整GM-CSF濃度至20ng/ml，IL-4濃度至10ng/ml，細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大。本實(shí)驗(yàn)在第三天開始加入IL-4，而不是在本實(shí)驗(yàn)開始前加入，是考慮IL-4與GM-CSF作用相抵觸之處。TNF-α能抑制粒細(xì)胞的產(chǎn)生，同時(shí)誘導(dǎo) DC的成熟［10］，可以將成熟的DC數(shù)量提高10%～15%。

由于DC來源復(fù)雜，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)一種表面分子能夠代表不同組織及不同分化時(shí)期的所有DC的特異性標(biāo)記，目前通常采用細(xì)胞形態(tài)、表型及異基因淋巴細(xì)胞刺激能力三者相結(jié)合的方法。

據(jù)報(bào)道33D1、凝集素類似受體 NLDC-k145、DEC-205及整合素CD11c［11］被認(rèn)為是小鼠DC較特異性的表面標(biāo)記，在這3種表面分子中，CD11c是相對分子質(zhì)量為150 000的β2整合素家族成員，髓樣樹突狀細(xì)胞表達(dá)髓源性抗原CD11c，CD11c是確定DCs特異性表面標(biāo)志物之一，與CD86相比，包括DC前體、未成熟及活化成熟的DC均有較高的表達(dá)率［12］。CD86是細(xì)胞表面黏附因子，也是激活T細(xì)胞的第2信號分子，可作為DC的活性指標(biāo)［13］。

不成熟DC具有很強(qiáng)的吞噬、加工處理抗原的能力，但是對T細(xì)胞的刺激功能比較低，其表面低表達(dá)甚至不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子如CD40、CD80和CD86。未成熟DCs捕獲抗原后，并在一些活化因子(如 LPS、IL-1β、TNF-α 等)作用下可分化為成熟DCs，其表面MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子的表達(dá)顯著上調(diào)，其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，對T細(xì)胞的刺激功能增加，但抗原攝取能力下降［14］。

本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD11c添加TNF-α前后的陽性表達(dá)率無差別，CD86加入TNF-α后陽性表達(dá)率較加入 TNF-α前明顯增加。說明未成熟DC和成熟DC，CD11c均有較高表達(dá)，成熟DC較未成熟DC，CD11c表達(dá)無明顯增高，說明CD11c是DC的特異性表面標(biāo)志物，CD86在成熟DC表達(dá)較未成熟DC高。說明TNF-α能提高CD34+干細(xì)胞表面GM-CSF受體數(shù)量，促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)CD86，阻斷粒細(xì)胞分化途徑，促進(jìn)DC分化、成熟［15］。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)rmGM-CSF和rmIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)，可以從小鼠骨髓獲得大量具有典型DC形態(tài)學(xué)特征及生物學(xué)特征的樹突狀細(xì)胞，這為DC疫苗的研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 徐 榕，江虹虹，宋海峰．樹突狀細(xì)胞疫苗研究的新策略［J］．中國腫瘤，2011，20(2):92-97．

［2］ Steinman RM，Chon ZA．Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice．Imorphology，quantitation，tissue distribution［J］．Exp Med，1973，137(5):1142-1162．

［3］ Chauvin C，Josien R．Dendritic cells as killers:mechanistic aspects and potential roles［J］．J Immunol，2008，139(5):671-676．

［4］ Brok MH，Nierkens S，F(xiàn)igdor CG，et al．Dendritic cells:tools and targets for antitumor vaccination［J］．Expert Rev Vaccines，2005，5(4):699-710．

［5］ Banchereau J，Palucka AK．Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer［J］．Nat Rev Immunol，2005，5(4):296-306．

［6］ Gong J，Koido S，Calderwood SK．Cell fusion:from hybridoma to dendritic cell-based vaccine［J］．Expert Rev Immunol，2008，7(7):1055-1068．

［7］ 易輝君，盧光琇．不同來源血清或血漿培養(yǎng)條件下的樹突狀細(xì)胞表型和功能的比較［J］．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28(6):561-563．

［8］ 郭慈仁，歐啟水，李良慶．小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞體外擴(kuò)增和鑒定［J］．福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38(3):261-263

［9］ 劉 錚，代繼宏，符 州，等．小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及初步鑒定［J］。南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28(2):25-31．

［10］孫國龍，王凱忠，周 莉，等．小鼠骨髓及脾臟來源的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定［J］．中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16(3):408-411

［11］ Makala LH，Nishikawa Y，Mishima M，et al．Phenotype and unction of murine peritoneal cavity macrophage derived dendriticells［J］．J Vet Med Sci，2002，64(9):813-820

［12］ Reschner A，Hubert P，Delvenne P，et al．Innate lymphocyte and dendritic cell cross-talk:a key factor in the regulation of the immune response［J］．Clin Exp Immunol，2008，152:219-226．

［13］ Guermonp rez P，Valladeau J，Zitvogel L，et al．Antigen p resentation and T cell stimulation by dendritic cells［J］．Immunol，2002，20:621-667．

［14］ Liu Q，Shu X，Sun A，et al．Plant-derived small molecule albaconol suppresses LPS triggered proinflammatory cytokine production and antigen presentation of dendritic cells by impairing NF-kB activation ［J］．Int Immunopharmacol，2008，8:1103-1111．

［15］熊 菲．影響樹突狀細(xì)胞分化成熟因素的研究進(jìn)展［J］．國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊，2005，28(2):107-111．