柳曉春，鄧凱賢，鄭玉華，彭 敏，周東華，謝慶煌，潘淑芬

(廣東省佛山市婦幼保健院，廣東佛山528000)

在世界范圍內(nèi)，浸潤性子宮頸癌(Invasional Cervical Cancer，ICC)是嚴重威脅婦女健康的主要惡性腫瘤之一，早期篩查和治療是其治療的重點。在過去的幾十年里，中國廣泛地開展了宮頸癌篩查工作，使子宮頸癌病死率有所下降，但每年仍然有約12萬新發(fā)病例［1］。目前，宮頸細胞學(xué)檢查和(或)HPV病毒檢測已較成熟地運用于宮頸癌及癌前病變的篩查并取得了良好效果，但其應(yīng)用有一定的局限性，亟待探索更為有效的篩查方案，重點在發(fā)現(xiàn)和預(yù)測高級別宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)。近年來人端粒酶RNA基因(human telomerase RNA gene，hTERC)成為宮頸癌發(fā)病機理的研究熱點，有研究證實，端粒酶被激活是HPV整合入宮頸細胞后由CIN向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟，其出現(xiàn)為有效提高宮頸癌早期篩查效率帶來新的希望［2］。本研究將hTERC檢測、液基薄層細胞學(xué)技術(shù)(thinprep liquidbased cytology test，TCT)、高危人乳頭狀瘤病毒(high risk human papilloma virus，HR-HPV)檢測聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌的早期篩查，旨在探討和分析TCT技術(shù)結(jié)合HPV分型和hTERC基因檢測在婦女宮頸病變篩查中的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1．1 研究對象

選擇2010年5月至2012年1月因懷疑宮頸病變在佛山市婦幼保健院宮頸門診行TCT檢查的患者100例為研究對象，年齡20～65歲，平均年齡41歲±10．6歲。同時行HR-HPV檢查、hTERC檢測及陰道鏡下病理活組織檢查。所有患者均非孕期及經(jīng)期，取材前3天內(nèi)無性生活、陰道沖洗及用藥史等。以病理組織學(xué)為金標準，其結(jié)果包括非CIN病變18例、CIN65例(包括CIN1 24例，CIN2 21例、CIN3及原位癌20例)、浸潤性宮頸癌(SCC)17例。按各自病理改變分為5組。

1．2 篩查程序及結(jié)果判斷

1．2．1 標本采集及TCT 按TCT常規(guī)程序進行，細胞學(xué)診斷采用2001年TBS(the Bethesda System)系統(tǒng)進行細胞學(xué)診斷，即未見上皮內(nèi)病變及惡性細胞(NILM)、意義不明不典型鱗狀細胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變(HSIL)、鱗狀上皮癌(SCC)和腺癌 。ASCUS及以上病變即判為細胞學(xué)檢查陽性。標本經(jīng)制片后留取剩余液基，用于hTERC基因及HPV檢測。

1．2．2 HCⅡ法檢測HR-HPVDNA 應(yīng)用美國Digene公司第二代雜交捕獲試驗(hybridcapture，HC2)檢測13種高危HPV DNA含量，高危型HPV DNA＞l pg/ml者定為陽性，操作過程按試劑盒說明書進行。

1．2．3 免疫熒光原位雜交法(FISH)檢測 hTERC基因異常擴增 TCT方法取材，hTERC探針由北京金菩嘉醫(yī)療科技公司提供，為hTERC/CSP3DNA探針，按探針試劑盒說明操作。用OLYMPUSB×51熒光顯微鏡觀察間期細胞熒光雜交信號，用Video Test公司提供的FISH分析軟件分析圖像，評估整個涂片的CSP3和hTERC基因雙色探針雜交情況。結(jié)果判斷:至少計數(shù)信號完整的100個細胞。在100×物鏡下觀察癌細胞核的FISH結(jié)果并進行信號計數(shù)和比值計算。將觀察到的信號記錄為CSP3信號數(shù):TERC信號數(shù)(即綠:紅)，正常二倍體為2∶2，出現(xiàn)其他類型為異常細胞類型。計算出閾值(閾值=均數(shù)+3×標準差SD)為6，超過或等于閾值標準為hTERC基因擴增陽性。陽性檢測結(jié)果的判定標準:每例標本整張片隨機計數(shù)≥100個細胞，如果所檢細胞中出現(xiàn)2個以上紅色信號的細胞百分比大于上述正常閾值者即為陽性，表示hTERC基因擴增異常，小于正常閾值者即為陰性，表示hTERC基因擴增正常，等于正常閾值者應(yīng)增加受檢細胞個數(shù)再確定結(jié)果。

1．2．4 病理學(xué)檢查 陰道鏡下對病變最嚴重處多點取材活檢，如無異常，則常規(guī)取移行帶第3、6、9、12點4處。標本固定后行病理檢查，結(jié)果包括炎癥(非 CIN)、CIN1、CIN2、CIN3 和浸潤癌(SCC)5 組。其中CINI為低級別CIN病變，CIN2和3為高級別CIN病變。

1．2．5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件包，各組計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢驗水平(α)為0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同病理分型患者細胞學(xué)(TCT)檢查情況

LSIL包括 HPV感染和 CIN1，HSIL包括 CIN2及CIN3［3］。非CIN組TCT結(jié)果中，出現(xiàn)2例ASCUS，占11．1%(病理學(xué)證實為炎性)。CIN1組中有3例 NILM，6 例 ASC-US，1 例 HSIL，共占 41．7%。CIN2患者中有2例 ASC-US，5例出現(xiàn) LSIL，共占32．33%。CIN3患者中有2例出現(xiàn)ASC-US，4例出現(xiàn)LSIL，共占30%。浸潤癌組有2例出現(xiàn)LSIL，2例出現(xiàn)HSIL，共占23．53%。見表1。

表1 不同病理分型患者宮頸脫落細胞TCT診斷結(jié)果(%)

2．2 不同病理分型患者高危HPV及hTERC基因表達情況

隨著宮頸病變病理級別的遞增，脫落細胞高危HPV的表達及hTERC基因擴增出現(xiàn)遞次增高。高危HPV感染在CIN組及浸潤癌組中的表達率均較高，統(tǒng)計分析非CIN組與CIN組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7．31，P ＜0．01)，CIN 各組感染率均較高，但三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ21:2=0．83，χ21:3=1．16，χ22:3=1．02，P 均 ＞ 0．05)，CIN 組與宮頸浸潤癌組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1．35，P ＞ 0．05)。FISH檢測hTERC基因擴增率，高級別CIN組(包括CIN2及CIN3)明顯高于低級別CIN1組(χ2=9．22，P＜0．01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 不同病理分型患者hTERC及高危HPV檢測結(jié)果

2．3 TCT、高危HPV及hTERC基因擴增與病理檢查結(jié)果比較

TCT可篩查出大部分非CIN病變，復(fù)合率達88．9%，與CIN病變組及宮頸癌組相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2 非CIN:CIN=8．96，χ2 非CIN:宮頸癌 =11．34，P均 ＜0．01)，但CIN 組與宮頸癌變組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0．92，P ＞0．05)，且篩查高級別CIN病變及宮頸癌篩查率與低級別CIN組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1．31，P ＞0．05)。高危 HPV 檢查篩查高級別CIN病變及宮頸癌與低級別CIN組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0．92，P ＞ 0．05)。hTERC 基因在高級別CIN病變及宮頸癌中的擴增較低級別CIN病變差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7．63，P ＜0．01)。經(jīng)計算 TCT檢測宮頸病變靈敏度53．4%、特異度92．5%，高危HPV檢測宮頸疾病靈敏度96．7%、特異度44．6%，hTERC基因擴增識別高級別CIN病變及宮頸癌特異度98．6%，靈敏度71．7%?？梢?，三種方法在宮頸病變的篩查中各有優(yōu)缺點:細胞學(xué)檢查篩查宮頸病變特異性高但靈敏度差，高危HPV檢測靈敏度高但特異性差，兩者結(jié)合可有效提高宮頸病變檢出率，但均不能較好區(qū)別低級別與高級別CIN病變。hTERC基因擴增識別高級別CIN及宮頸癌特異度高，但因?qū)Φ图墑e宮頸病變識別率低，不能用于宮頸病變普通篩查，結(jié)合TCT及高危HPV檢測兩種方法應(yīng)用則可在提高宮頸病變檢出率同時有效提高高危CIN識別效率。見表3。

表3 三種檢測方法與病理檢查結(jié)果比較(%)

3 討論

宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一，但由于宮頸癌存在著一個較長的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期，早期患者5年治愈率高達90%，因此有效地開展宮頸癌篩查是降低其發(fā)病率和病死率的唯一途徑。液基細胞學(xué)(以TCT為代表)是宮頸癌前病變篩查的一大革命，使細胞學(xué)篩查的準確度和滿意度得到提高，成為目前最常用的宮頸癌篩查手段。但細胞學(xué)篩查仍存在重復(fù)性差且主觀性強，不能明確意義的涂片結(jié)果較多等不足［4］。從本實驗結(jié)果我們可以看到，TCT對非CIN病變診斷符合率高達88．9%，但對CIN的診斷符合率不足70%，對浸潤癌的診斷符合率也僅有76．48%，其陰性率較高，一定程度上導(dǎo)致了宮頸癌及癌前病變的漏檢。本研究中TCT對高級別CIN病變和低級別CIN病變的篩查率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)，提示TCT缺乏識別高級別CIN病變與低級別CIN病變的特異性，特異性高但靈敏度較差。

大量流行病學(xué)和生物學(xué)資料已經(jīng)證明HR-HPV感染是宮頸癌及其癌前病變的最主要病因，特別是高危型、持續(xù)性感染是引起子宮頸癌前病變和宮頸癌的主要原因［5］。HR-HPV篩查宮頸癌及癌前病變具有較高的靈敏度，如本實驗中發(fā)現(xiàn)CIN病變患者高危HPV感染率均超過90%，浸潤癌感染率達100%。液基細胞學(xué)技術(shù)聯(lián)合HR-HPV檢測是較理想的宮頸癌篩查方案，兩者相結(jié)合能明顯提高宮頸病變的檢出率，較大限度地降低宮頸癌的漏診率。但HPV感染率很高，大多數(shù)婦女感染HPV是暫時的，只有持續(xù)感染，病毒DNA整合入細胞DNA組才能導(dǎo)致高級別CIN發(fā)生［6］。因此，F(xiàn)R-HPV對宮頸上皮內(nèi)高度病變的陽性預(yù)測值始終很低，這在本研究中亦得到證實，高危HPV感染率在CIN1與CIN高級別病變組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。根據(jù)2009年美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)頒布的宮頸病變診療指南［7］，CIN1可予期待治療定期隨訪，而CIN2及3級則需要積極手術(shù)治療，阻斷其進一步向?qū)m頸癌發(fā)展，可見在已經(jīng)能做到廣泛應(yīng)用TCT和(或)HPV篩查宮頸癌的今天，如何早期、準確地識別高級別的CIN病變已成為宮頸癌篩查中的重點問題。

近年由美國NIH直接領(lǐng)導(dǎo)的針對宮頸癌的研究表明，宮頸細胞由非典型向癌轉(zhuǎn)變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴增，其中，涉及到的最重要的基因可能是hTERC基因［8］。有研究證實宮頸癌細胞系、宮頸癌組織和CIN中均存在hTERC基因擴增，hTERC基因的異?？截悢?shù)增加可能是宮頸癌形成的早期事件。該基因的擴增可阻止細胞凋亡，因而可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)3號染色體長臂能準確區(qū)分高級別CIN與低級別CIN，鑒別診斷的特異性及敏感性均在90%以上;這一擴增也能預(yù)測52%～96%的CIN有惡變的可能［9］。本研究發(fā)現(xiàn)各組病變中均有hTERC基因的表達，但主要表達在宮頸病變的高級別的宮頸上皮內(nèi)病變階段，其表達率與宮頸病變程度密切相關(guān)，隨著病變級別升高，基因擴增率呈上升趨勢，高度CIN病變組基因擴增率明顯高于低度CIN病變組(P＜0．01)，結(jié)論與國內(nèi)外研究相吻合。提示hTERC可能是宮頸癌形成的早期事件，TERC基因異常擴增診斷CINlI及以上病變具有良好的敏感度、特異度，敏感度明顯高于細胞學(xué)檢查，特異度明顯高于HPV檢測，可用于早期診斷宮頸癌，可能是宮頸病變進展的預(yù)測性指標。

綜上所述，通過研究我們發(fā)現(xiàn)細胞學(xué)檢查在宮頸癌的篩查中具有較高的特異性但靈敏度較差，高危HPV檢測靈敏度高但特異性差，兩者結(jié)合能有效地提高宮頸癌及癌前病變的檢出率，但無法特異地識別高級別CIN與低級別CIN。hTERC基因在宮頸組織的表達率與宮頸病變程度密切相關(guān)，F(xiàn)ISH法檢測hTERC基因聯(lián)合高危HPV-DNA和細胞學(xué)檢測這兩項傳統(tǒng)的宮頸癌篩查技術(shù)，可以大大提高宮頸癌前病變的陽性檢出率，可以較特異地識別出具有較高的轉(zhuǎn)化為宮頸癌潛能的高級別CIN病變。對細胞學(xué)和(或)HPV陽性的患者進一步行hTERC基因檢測，可較好地識別出具有發(fā)展為宮頸癌趨勢的高危人群，通過早期診斷和治療而降低宮頸浸潤性癌的發(fā)病率。對細胞學(xué)陰性和(或)HPV陰性但hTERC陽性的患者亦應(yīng)增加隨訪力度，預(yù)防宮頸癌及癌前病變的發(fā)生。

［1］ 周 權(quán)，黃民主，黃 霜，等．中國已婚婦女宮頸癌發(fā)病影響因素 Meta分析［J］．中國癌癥雜志，2011，21(2):125-129．

［2］ Jarboe EA，Liaw KL，Thompson LC，et al．Analysis of telomerase as a diagnostic biomarker of cervical dysplasia and carcinoma［J］．Oncogene，2002，21(4):664-673．

［3］ 蔣芝蓉，蔡金尾，李 俊．液基細胞學(xué)(TCT)篩查子宮頸癌前病變(CIN)及子宮頸癌評價的臨床意義［J］．四川醫(yī)學(xué)，2008，29(11):1523-1524．

［4］ Wright TC Jr，Massad LS，Dunton CJ，et al．2006 consensus guidelines for the management of women with abnormal cervical cancer screening tests ［J］．Am J Obstet Gynecol，2007，197(4):346-355．

［5］ Castle PE，F(xiàn)etterman B，Poitras N，et al．Variable risk of cervical precancer and cancer after a human papillomavirus-positive test［J］．Obstet Gynecol，2011，117(3):650-656．

［6］ Katki HA，Kinney WK，F(xiàn)etterman B，et al．Cervical cancer risk for women undergoing concurrent testing for human papillomavirus and cervical cytology:a population-based study in routine clinical practice［J］．Lancet Oncol，2011，12(7):663-672．

［7］ Apgar BS，Kittendorf AL，Bettcher CM，et al．Update on ASCCP consensus guidelines for abnormal cervical screening tests and cervical histology［J］．Am Fam Physician，2009，80(2):147-155

［8］ Caraway NP，Khanna A，Dawlett M，et al．Gain of the 3q26 region in cervicovaginal liquid-based pap preparations is associated with squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinoma［J］．Gynecol Oncol，2008，110(1):37-42．

［9］ Heselmeyer-Haddad K，Sommerfeld K，White NM，et al．Genomic amplification of the human telomerase gene(TERC)in Pap smears predicts the development of cervical cancer［J］．Am J Pathol，2005，166(4):1229-1238．