余響華+沈玉平+劉小文+張祖嬌

摘要：從南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部樹皮內(nèi)表皮中分離得到69株內(nèi)生真菌，通過HPLC檢測發(fā)酵液中紫杉醇含量，共獲得7種紫杉醇產(chǎn)生菌，同時(shí)，通過形態(tài)學(xué)分析以及ITS序列分析確定分別屬于鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢盤菌屬（Botryotinia sp.）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）和枝孢菌（Cladosporium），其中鏈格孢屬真菌紫杉醇產(chǎn)量最高，平均為271.54 μg/L，是目前見諸報(bào)道的產(chǎn)量最高的鏈格孢菌，亦是從紅豆杉根部樹皮中篩選出的紫杉醇產(chǎn)量較高的野生菌株之一。該菌株的發(fā)現(xiàn)為紫杉醇高產(chǎn)菌的選育提供了又一優(yōu)良的種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：紫杉醇；南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）；內(nèi)生真菌；ITS序列；HPLC

中圖分類號(hào)：Q946.8；Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）19-4552-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.011

Isolation and Identification of Endophytic Fungus Producing Paclitaxel

from Taxus chinensis var. mairei

YU Xiang-hua， SHEN Yu-ping， LIU Xiao-wen， ZHANG Zu-jiao

（Department of Life Science & Chemical Engineering， Hunan University of Science and Engineering ，Yongzhou 425100，Hunan， China）

Abstract： 69 strains of endophytes were isolated from root skin of Taxus chinensis var. mairei， which were belonged to 16 genera（groups） according to their morphological character. HPLC method was used to detect the concentration of paclitaxel in ferment. 7 strains were detected with the ability to synthesize paclitaxel. Combined with ITS sequence analysis， these 7 strains were identified as Alternaria、Botryotinia、Colletotrichum、Phomopsis and Cladosporium sp. The Alternaria sp. had the highest paclitaxel productivity， with the average up to 271.54 μg/L. It will provide another resource for selecting of high-yield strain of paclitaxel.

Key words： paclitaxel； Taxus chinensis var. mairei； endophytic fungi； ITS； HPLC

紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）是一種具有廣譜抗癌活性的三環(huán)二萜類化合物，1971年從太平洋短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中分離獲得[1]，Schiff等[2]隨后證實(shí)紫杉醇具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制。采用微生物發(fā)酵法，即從紅豆杉植物中尋找紫杉醇產(chǎn)生菌并加以菌種改良，結(jié)合微生物發(fā)酵技術(shù)以提高產(chǎn)量，是目前公認(rèn)的環(huán)境友好、成本低廉的解決紫杉醇生產(chǎn)原料來源危機(jī)的好方法[3]。

自1993年Stierle等[4]從太平洋短葉紅豆杉樹皮中分離出可產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌以來，國內(nèi)外學(xué)者相繼開展了篩選產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的研究，到目前為止，人們已發(fā)現(xiàn)了20多個(gè)屬的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生紫杉醇[5]，分離部位大部分取自樹干和樹枝。本研究從南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部采集樹皮，從中分離篩選內(nèi)生真菌，測定其產(chǎn)紫杉醇性能，以及通過形態(tài)特征和ITS序列分析對(duì)其進(jìn)行了分類。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部樹皮，來源于湖南省永州市陽明山國家森林公園內(nèi)的野生紅豆杉，樣品采集后迅速裝入無菌塑料袋中，4 ℃保存。

1）培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，瓊脂 2.0%，滅菌后冷卻至40～50 ℃ 加入 25 mg/L鏈霉素，半固體培養(yǎng)基瓊脂濃度減半。液體種子培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基不加瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）[6]：葡萄糖 1.0，果糖3.0，蔗糖6.0，醋酸鈉1.0，酵母粉0.5，MgSO4 0.36，KH2PO4 0.5，乙酸鈉2.0，ZnSO4 2.5×10-3，MnSO4 0.5×10-3，Cu（NO3）2 0.65，KCl 0.06，Ca（NO3）2 2×10-3， FeCl2 2×10-3，苯丙氨酸 5×10-3，苯甲酸鈉 0.5，KH2PO4 0.136。

2）試劑。紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度>95%，Sigma）， HPLC 流動(dòng)相甲醇為色譜純， 水為三蒸水，Ezup柱式真菌基因組抽提試劑盒（SK8259） ，PCR Buffer（10×），dNTP（10 mol/L），Taq酶（5U/μL），引物：ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ 和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由上海鉑尚生物合成）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

3）儀器。日本島津LC-10ATvP高效液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、BIO-RAD PCR儀、恒溫?fù)u床。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與純化 將南方紅豆杉樹皮置于無菌條件下，剝除根部外皮，留取內(nèi)皮和韌皮部，切割成邊長為0.5 cm×0.5 cm的正方形小塊，用75%的乙醇表面消毒2～3 min，無菌水漂洗2～3次；濾紙吸干水分，斜插入半固體培養(yǎng)基中，每皿6～8塊樹皮，共50皿。28 ℃培養(yǎng)3～7 d，挑取自真皮向培養(yǎng)基基質(zhì)生長的菌絲體微絲于固體培養(yǎng)基中，純化2～3次，編號(hào)，保藏備用。

1.2.2 菌株的鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。將分離到的菌株于固體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)，每隔12 h記錄菌落形態(tài)變化；顯微形態(tài)觀察采用插片法，40倍物鏡；綜合以上結(jié)果，依據(jù)菌落形態(tài)、菌絲體、孢子梗、營養(yǎng)細(xì)胞以及基質(zhì)變化等特征，參考《真菌鑒定手冊》進(jìn)行鑒定[7]。

2）分子生物學(xué)鑒定。按上海生工SK8259真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，以此為模板擴(kuò)增ITS序列（擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃、5.0 mim； 94 ℃、30 S，55 ℃、35 S， 72 ℃、1.0 min， 35個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸 8.0 min）

測序由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成，所得序列經(jīng)EMBL數(shù)據(jù)庫中的BLAST比對(duì)分析，并利用DNAMAN和MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 28 ℃接種待培養(yǎng)菌株至固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 d，無菌生理鹽水洗下孢子，接種至20 mL裝液量的液體種子培養(yǎng)基中，3皿/瓶，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)14～16 h后，將液體種子以8%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d。

1.2.4 紫杉醇的提取 發(fā)酵液4 800 r/min離心 20 min，收集上清液；所得菌體沉淀以 20 000 r/min 勻漿 15～20 min，使目標(biāo)產(chǎn)物充分釋放，再離心；將兩次上清液合并，雙層濾紙過濾，濾液 50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的 1/10，加入等體積氯仿充分振蕩進(jìn)行萃取，共萃取兩次，合并有機(jī)相，無水Na2SO4 干燥，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，樣品加少量甲醇溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾， 定容至10 mL 備用。

1.2.5 樣品中紫杉醇含量的檢測

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。精確稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg， 用10 mL甲醇溶解，配成100 mg/L母液備用。將母液稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2）色譜條件。日本島津LC-10ATvP高效液相色譜儀，Kromstar C18 柱（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相， 甲醇∶水（V/V） =65∶35；流速1.0 mL/min， 檢測波長227 nm， 柱溫28 ℃， 進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

從南方紅豆杉樹皮中分離出69株內(nèi)生真菌， 依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定，確定其分屬16屬。每個(gè)屬中挑選生長性狀優(yōu)良的菌株，進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定其發(fā)酵物的紫杉醇含量，相同種屬菌株取紫杉醇產(chǎn)量平均值，未檢出者則視為無效菌株，不在表內(nèi)列出。共獲得7株產(chǎn)紫杉醇菌株，對(duì)應(yīng)的鑒定結(jié)果及紫杉醇產(chǎn)量見表1。

2.2 紫杉醇含量的檢測

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取所配的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為■=16 518x-9475.1，r2= 0.998 1。結(jié)果表明，回歸方程在0～40 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1）。

2.2.2 發(fā)酵液中紫杉醇的檢測 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品和鏈格孢屬菌株（YEP751）發(fā)酵提取物的HPLC檢測結(jié)果見圖2和圖3。在相同色譜條件下，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為23.574 min，菌株發(fā)酵濃縮液在此時(shí)間處有一明顯對(duì)應(yīng)峰，即檢測到菌株代謝產(chǎn)物中含有紫杉醇。

2.3 紫杉醇產(chǎn)生菌的分子生物學(xué)鑒定

菌株YEP731、YEP822和YEP751 的ITS擴(kuò)增序列分別為564、599、532 bp，該序列在EMBL數(shù)據(jù)庫中經(jīng)BLAST比對(duì)，顯示與鏈格孢屬真菌（Alternaria sp.）有極高的同源性（99%），系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4） 結(jié)果亦表明這3株菌株與鏈格孢屬真菌的親緣關(guān)系最近；菌株YEP821與葡萄孢盤菌屬真菌（Botryotinia sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP742與葡萄刺盤孢屬真菌（Colletotrichum sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP442與擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis sp.）的ITS序列有99%的一致性；菌株YEP611與枝孢菌屬真菌（Cladosporium sp.）的ITS序列有99%的一致性。上述相關(guān)序列均在ENA（European Nucleotide Archive）完成注冊，相應(yīng)EMBL登錄號(hào)為HG530662-HG530668。

3 討論

本試驗(yàn)從南方紅豆杉的根部樹皮中分離得到69株內(nèi)生真菌，形態(tài)學(xué)鑒定其分屬16屬， 通過HPLC法檢測發(fā)酵物中紫杉醇的含量， 發(fā)現(xiàn)有7株菌株能夠產(chǎn)生紫杉醇， 再經(jīng)過ITS序列分析確定分別屬于鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢盤菌屬（Botryotinia）、刺盤孢屬（Colletotrichum）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）和枝孢菌屬（Cladosporium）。 其中鏈格孢屬真菌（Alternaria）平均產(chǎn)量為271.54 μg/L（其中一株產(chǎn)量更是高達(dá)303.06 μg/L），是目前見諸報(bào)道的產(chǎn)量最高的鏈格孢菌[8-11]，亦是從紅豆杉根部樹皮中篩選出的紫杉醇產(chǎn)量較高的野生菌株之一[5]。隨著后續(xù)研究的跟進(jìn)，其紫杉醇產(chǎn)量有望躍上一個(gè)新臺(tái)階。

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