非小細胞肺癌中缺氧誘導因子-1α和p-糖蛋白的表達及其與人乳頭狀瘤病毒感染的相關性

周 穎，張 輝，謝永紅，趙 敏，沈 彥，尹端端

0 引 言

缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，已有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過度表達。p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)介導的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)在人類腫瘤中具有普遍性，由MDR/p-gp介導的耐藥機制在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中亦占有重要地位。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種DNA病毒，感染人和動物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，越來越多的國內(nèi)外臨床和實驗室研究檢測出肺癌患者攜帶HPV［1-2］，尤其是HPV 16、18型。HPV感染與肺癌的關系，目前說法不一，肺癌中HIF-1α、p-gp與HPV感染的關系亦報道較少。本研究通過研究NSCLC中HIF-1α和p-gp的相關性，探討HIF-1α和p-gp在NSCLC發(fā)生發(fā)展及MDR中的作用，并初步分析其與HPV感染的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集我院2012年1-5月NSCLC患者的手術標本60份作為NSCLC組，患者中男46例，女14例;鱗癌42例，腺癌18例;高分化12例，中分化29例，低分化19例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例;有吸煙史43例，無吸煙史17例。另以20份肺良性病變組織作為對照，其中包括肺結(jié)核6份，炎性假瘤5份，硬化性血管瘤4份，肺大皰4份，支氣管擴張1份。標本取材后，部分置-20℃保存，部分中性甲醛固定，石蠟包埋。

1.2 HPV PCR 檢測

1.2.1 引物 選用分別用來擴增HPV16、18型的特異性引物2對。HPV16E6正義鏈:5'-CTGCAAGCAACAGTTACTGCGACG-3'，反義鏈:5'-CATACATCGACCGGTCCACC-3'，長度 315 bp;HPV18E7 正義鏈:5'-GAGCCGAACCACAACGTCAC-3'，反義鏈:5'-GGATGCACACCACGGACACA-3'，長度152bp。引物均由北京奧科生物公司合成。

1.2.2 組織DNA的提取 取適量凍存組織，加提取緩沖液制成單細胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復抽提3次，再經(jīng)100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加 TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，PH 8.0)緩沖液溶解所得DNA并4℃保存。

1.2.3 PCR擴增反應 PCR反應體系:每25 μL反應體系中包含 10 × buffer 2.5 μL，20 pmol/μL 引物各 0.5 μL，Taq 酶 1 μL(1 U/μL)，Mg2+1.5 μL，dNTPs 0.5μL，去離子水16.5μL 及DNA 模板2μL。擴增條件:94℃預變性5min，循環(huán)特征為94℃ 45s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30 個循環(huán)，72℃延伸8 min。每次實驗以不加模板為陰性對照，HPV16、18型分別用Siha和Hela細胞株DNA作陽性對照。PCR擴增產(chǎn)物用加有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳約40 min，于紫外透射儀上觀察結(jié)果。

1.3 免疫組化檢測HIF-1α、p-gp的表達

1.3.1 試劑與方法 HIF-1α 抗體、p-gp抗體及通用型SP試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司，染色步驟嚴格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1∶100。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3.2 判斷標準 HIF-1α陽性表達為細胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，p-gp陽性表達為細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，顯色結(jié)果由2位病理醫(yī)師采用半定量評分系統(tǒng)獨立判定。每例均高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果:0分陰性;1分＜25%;2分25% ～75%;3分＞75%。陽性強度:1分弱表達(淺黃色);2分中等強度表達(棕黃色);3分強表達(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強陽性(2+)。

1.4 統(tǒng)計學分析 用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，率的比較用χ2檢驗及確切概率法，參數(shù)間的相關性采用Spearman等級相關分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α、p-gp的檢測結(jié)果及兩者的相關性NSCLC組中HIF-1α的陽性表達位于細胞核，陽性率為48.3%(29/60)，肺良性病變未見陽性表達(χ2=15.163，P ＜0.05)。p-gp 的陽性表達位于細胞膜或細胞質(zhì)，陽性率為60.0%(36/60)，肺良性病變組未見陽性表達(χ2=21.818，P ＜0.05)。HIF-1α陽性者中p-gp的表達率明顯高于HIF-1α陰性者，兩者呈正相關(r=0.313，P ＜0.05)。見表1。

表1 NSCLC組織中HIF-1α與p-gp表達的關系［n(%)］Table 1 Relationship between HIF-1α and p-gp expression in NSCLC n(%)

2.2 HIF-1α、p-gp表達與臨床病理特征的關系NSCLC組HIF-1α表達與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，高分化型HIF-1α表達率低于中、低分化型，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α表達率高于無轉(zhuǎn)移者，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。NSCLC組p-gp表達與性別、年齡、吸煙、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關，與組織學分型相關，肺腺癌表達率高于肺鱗癌，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 NSCLC組織中HIF-1α、p-gp表達、HPV感染與臨床病理特征的關系［n(%)］Table 2 Relationship between HIF-1α，p-gpexpression，HPV infection and clinicopathological data in NSCLC n(%)

2.3HPV DNA的PCR檢測結(jié)果及與臨床病理特征的關系 NSCLC組 HPV DNA檢出率為41.7%(25/60)，肺良性病變組5.0%(1/20)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.193，P ＜0.05);HPV16、18 型特異性引物分型檢測，HPV16 型12例，檢出率為48.0%(12/25)，18 型13例，檢出率為52.0%(13/25)。NSCLC組 HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。高分化型HPV DNA檢出率低于中、低分化型，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HPV DNA檢出率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 PCR檢測HPV16、18型DNA擴增結(jié)果電泳圖Figure 1 Electrophoresis of HPV16/18 DNA detected by PCR

2.4 HIF-1α、p-gp的表達與 HPV感染的關系HPV DNA陽性者與陰性者間HIF-1α的陽性表達率分別為52.0%和45.7%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HPV DNA陽性者與陰性者間p-gp的陽性表達率分別為64.0%和57.1%，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

3 討 論

HIF-1是由α、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調(diào)節(jié)［3］。缺氧是實體腫瘤微環(huán)境特征之一。在細胞缺氧時，細胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進腫瘤的血管形成和腫瘤的發(fā)展，而且可反饋接受腫瘤生長過程中產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境上調(diào)表達，如此形成惡性循環(huán)促進腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移［4］。本研究中，HIF-1α在 NSCLC組中陽性表達率48.3%，肺良性病變組未見陽性表達，提示HIF-1α參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果還顯示，HIF-1α的表達與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，與 Swinson等［5］的結(jié)果基本一致。高分化型HIF-1α的表達率低于中、低分化型，推測腫瘤分化程度降低，缺氧程度明顯加重，HIF-1α表達上調(diào)，通過與缺氧反應元件作用便利于腫瘤克服缺氧并誘導新生血管形成，浸潤生長。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α的表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其機制可能為HIF-1α通過調(diào)節(jié)其下游基因VEGF誘導腫瘤新生淋巴管形成，同時上調(diào)COX-2，促使癌細胞對基質(zhì)的黏附性增加，E-cadherin蛋白水平下降，使癌細胞易于轉(zhuǎn)移［6］，提示HIF-1α是NSCLC發(fā)生發(fā)展中的關鍵步驟，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

p-gp是最早發(fā)現(xiàn)和克隆的耐藥蛋白，目前認為p-gp是一種藥物排出泵，將進入細胞的化療藥物排出，導致細胞內(nèi)化療藥物濃度降低而引起耐藥［7］。p-gp介導的MDR在人類腫瘤中具有普遍性［8］。本研究中，p-gp在NSCLC組中的陽性表達率60.0%，肺良性病變組未見陽性表達，且肺腺癌p-gp的表達率高于肺鱗癌，符合臨床上鱗癌比腺癌對化療藥物敏感的現(xiàn)象［9］。MDR1/p-gp是HIF-1α的一個靶基因，在MDR1/p-gp啟動子上存在HIF-1α的結(jié)合位點，HIF-1α可誘導MDR1/p-gp的表達增加，腫瘤耐藥性增強。Comerford等［10］研究表明 HIF-1α可調(diào)控MDR1/p-gp，誘導其表達上調(diào)，且進一步用反義寡核苷酸阻斷HIF-1α表達可導致MDR1 mRNA和p-gp表達下調(diào)。Waternberg等［11］在體外研究中也發(fā)現(xiàn)低氧微環(huán)境可上調(diào)p-gp表達，并需要HIF-1α參與［12］。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中HIF-1α陽性者p-gp的表達率高于陰性者，兩者呈正相關，提示HIF-1α可能通過上調(diào)p-gp的表達參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，并共同影響腫瘤耐藥。

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關系已經(jīng)引起人們的重視［13］。本研究證實NSCLC組HPV DNA檢出率與肺良性病變組差異有統(tǒng)計學意義，提示 HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一。HPV感染與NSCLC患者臨床病理資料的關系目前尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。高分化型NSCLC HPV DNA的檢出率低于中、低分化型，可能是由于分化成熟的細胞退出了細胞周期，細胞不再具有分裂能力，細胞內(nèi)僅有少量病毒復制所需的復制酶。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPV DNA的檢出率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Lane等［14］報道HPV陽性的腫瘤細胞株與HPV陰性的相比VEGF的表達水平普遍升高。Lopez-ocejo等［15］認為 HPV E6可能如一些原癌基因一樣能夠使VEGF表達增強。VEGF不僅誘導血管生成，還可誘導腫瘤外周形成新的淋巴管，促進癌細胞通過淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。由此推測HPV感染與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能存在一定的相關性。

HIF-1α與HPV感染之間的關系國內(nèi)外研究較少，其可能的聯(lián)系有:野生型P53蛋白可通過直接抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性和通過促進 mdm2介導的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解2種形式抑制HIF-1α活性。而 Munger［16］報道 HPV16、18 型 E6 可以降解野生型P53蛋白。HPV DNA陽性者HIF-1α的表達率稍高于陰性者，但差異無統(tǒng)計學意義，可能由于HPV通過P53對HIF-1α的影響是有限的，兩者的關系有待今后進一步的深入研究。HPV DNA陽性組與陰性組間p-gp的表達率差異無統(tǒng)計學意義，提示HPV感染與p-gp表達之間并無直接聯(lián)系，但也可能由于實驗的局限性影響到實驗的結(jié)果;另外也不排除HPV感染與p-gp表達之間可能通過多因素、多途徑相互作用，兩者相互關系及可能的內(nèi)部機制有待今后深入探討。

綜上所述，HIF-1α與p-gp參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及MDR。共同檢測NSCLC中HIF-1α與p-gp的表達對預測化療是否耐藥、評估患者預后有一定的參考價值。HIF-1α有望成為腫瘤治療的新靶點，通過阻斷HIF-1α從而降低腫瘤的MDR可達到治療腫瘤，提高患者生存率的目的。

［1］ Syrjanen KJ.HPV infection and lung cancer［J］.J Clin Pathol，2002，5(12):885-891.

［2］ Wang Y，Wang A，Jiang R，et al.Human papillomavirus type 16 and 18 infection is associated with lung cancer patients from the central part of China［J］.Oncol Res，2008，20(2):333-339.

［3］ 袁 媛，趙 明.糖尿病足截肢患者下肢血管缺氧誘導因子-1α及血管內(nèi)皮生長因子的表達［J］.醫(yī)學研究生學報，2011，24(5):490-494.

［4］ Jubb A，Hillan K.Expression of HIF-1 alpha in human tumours［J］.J Clin Pathol，2005，58(3):335-336.

［5］ Swinson DE，Jones JL，Cox G，et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha in non small cell lung cancer:relation to growth factor，protease and apoptosis pathways［J］.Int J Cancer，2004，111:43.

［6］ 李能蓮，李光明，駱亞莉，等.HIF-1α和HIF-2α在胃癌中的表達及意義［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2010，30(6):619-622.

［7］ Gottesman MM，Pastan I.Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter［J］.Annu Pev Biochem，1993，62(3):385-427.

［8］ 陳志偉，吳蘇稼.骨肉瘤組織中HER2、P-糖蛋白的表達與預后的關系［J］.醫(yī)學研究生學報，2005，18(5):462-464.

［9］ 羅春英，王 璇，時姍姍，等.非小細胞肺癌化療藥物敏感基因表達及其臨床病理特征分析［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(5):481-484.

［10］ Comerford KM，Wallace TJ，Karhausen J，et al.Hypoxia inducible factor-1 dependent regulation of the multidrug resistance(MDR1)gene［J］.Cancer Res，2002，62(12):3387-3394.

［11］ Wartenberg M，Ling FC，Muschen M，et al.Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor(HIF-1)and reactive oxygen species［J］.FASEB，2003，17(3):503-505.

［12］ Comerford KM，Cummins EP，Taylor CT.c-Jun NH2-terminal kinase activation contributes to hypoxia inducible factor-1 alphadependent P-glycoprotein expression in hypoxia［J］.Cancer Res，2004，64(24):9057-9061.

［13］ Zafer E，Ergun M，Alver G，et al.Detection and typing of human papillomavirus in non-small cell cancer［J］.Respiration，2004，71(1):88-90.

［14］ Lane D，Gray EA，Mathur RS，et al.Up-regulation of vascular endothelial growth factor-C by nicotine in cervical cancer cell lines［J］.Am J Reprod Immunol，2005，53(3):153-158.

［15］ Lopez-ocejo O，Viloria-petit A，Bequet-romero M，et al.Oncogenes and tumor angiogenesis:the HPV-16 E6 oncoprotein activates the vascular endothelial growth factor(VEGF)gene promoter in a p53 independent manner［J］.Oncogene，2000，19(40):4611-4620.

［16］ Munger K.The role of human papillomaviruses in human cancers［J］.Front Biosci，2002，7(3):641-649.