李宗軍，沈 毅，唐東方，金翔鳳，王耀鵬，矯文捷，隋愛華，劉玉洪

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003)

肺癌是世界上病死率最高的惡性腫瘤之一，其中約85%是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)［1］，5年生存率僅為20%～25%，死亡原因主要是腫瘤的局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。表皮生長因子受體(EGFR)是癌基因C-erbB-2產(chǎn)物的同源物，具有酪氨酸激酶的活性，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡抑制有關(guān)［2］;人類表皮生長因子受體2(HER-2)基因是重要的癌基因之一，其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和血管生成有關(guān)［3］。NSCLC組織中EGFR、HER-2蛋白表達(dá)的聯(lián)合檢測國內(nèi)少見報(bào)道。本研究利用免疫組化方法檢測了EGFR、HER-2蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)，分析了兩者間及與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，旨在為NSCLC的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科2011年10月～2012年10月收治的的NSCLC患者68例，男42例，女26例;年齡42～78歲(中位年齡62歲)，其中＜60歲35例、≥60歲33例;有吸煙史39例。均經(jīng)病理檢查確診，其中腺癌48例，鱗癌20例;低分化27例，中高分化41例;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ期28例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例?；颊咝g(shù)前均未接受過化療、放療及免疫治療。留取手術(shù)切除的腫瘤組織68份及癌旁正常肺組織(無癌細(xì)胞浸潤，距腫瘤病變＞5 cm)20份，10%甲醛中性緩沖液固定、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑 鼠抗人 EGFR單克隆抗體、鼠抗人HER-2單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 EGFR及HER-2蛋白的檢測方法 取上述石蠟切片，行常規(guī)HE染色及免疫組化SP染色。①脫蠟水化:60℃烤片1 h，二甲苯脫蠟2次、每次5 min，依次浸入梯度乙醇和蒸餾水中各5 min水化。②抗原修復(fù):將pH值為6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖溶液加入高壓鍋內(nèi)，修復(fù)切片完全浸于修復(fù)液中后蓋上壓力鍋蓋，加熱至均勻噴氣，1～2 min后壓力鍋離開熱源，自然冷卻至室溫，取出切片，蒸餾水淋洗，PBS漂洗2次、每次3 min。③封閉、染色:滴加試劑1(內(nèi)源性過氧化物酶封閉液)，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗;滴加試劑2(封閉用正常羊血清工作液)，室溫孵育10 min，甩干。分別滴加EGFR、HER-2一抗工作液(1∶100、1∶50)，室溫孵育 1 h，PBS 充分淋洗。滴加試劑3(生物素標(biāo)記羊抗鼠二抗工作液)，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗;滴加試劑4(HRP標(biāo)記的鏈霉親和素)，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗。滴加DAB顯色工作液顯色，顯色時(shí)間1～5 min，顯微鏡下觀察達(dá)最佳顯色效果后自來水沖洗;甩去自來水，滴加適量改良型蘇木素以覆蓋整個(gè)組織，復(fù)染30 s～3 min，自來水沖洗復(fù)染液，PBS或去離子水浸泡切片3～5 min，使胞核反藍(lán);脫水、透明、封片、鏡檢。EGFR表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，HER-2表達(dá)以細(xì)胞膜呈棕褐色顆粒狀為陽性。著色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn):不著色為0分(陰性)，輕度著色為1分(弱陽性)，中度著色為2分(陽性)，強(qiáng)著色為3分(強(qiáng)陽性);陽性細(xì)胞率(計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野)判定標(biāo)準(zhǔn):＜5%為0分，5%～30%為1分，31%～70%為2分，＞70%為3分。兩積分相乘之積≥1判為表達(dá)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。率的比較采用 χ2檢驗(yàn);EGFR、HER-2蛋白表達(dá)及與腫瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、HER-2蛋白表達(dá)及與 NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NSCLC組織及癌旁組織中EGFR蛋白陽性表達(dá)者分別為37例(54.4%)、0例，HER-2蛋白陽性表達(dá)者分別為45例(66.1%)、0例，陽性率兩兩比較，P 均 ＜0.05(χ2分別為 18.78、27.08)。EGFR蛋白表達(dá)與NSCLC病理類型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，P 均 ＜0.05(χ2分別為 9.88、14.80);與NSCLC分化程度、TNM分期及患者年齡、性別、吸煙情況無明顯相關(guān)(P均 ＞0.05)。HER-2蛋白表達(dá)與NSCLC的TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，P 均 ＜0.05(χ2分別為 8.12、8.06);與NSCLC分化程度、病理類型及患者年齡、性別、吸煙情況無明顯相關(guān)(P均＞0.05)。詳見表1。

表1 EGFR、HER-2蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 EGFR與HER-2蛋白在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性 68例NSCLC組織中EGFR、HER-2蛋白均陽性表達(dá)32例、均陰性表達(dá)18例，EGFR蛋白陽性表達(dá)而HER-2蛋白陰性表達(dá)5例、EGFR蛋白陰性表達(dá)而HER-2蛋白陽性表達(dá)13例。EGFR、HER-2 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，r為1.0(P ＜0.05)。

3 討論

近年來，我國NSCLC的發(fā)病率和病死率均有升高趨勢，治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療等。其中針對(duì)NSCLC患者EGFR基因表達(dá)的分子靶向治療藥物(EGFR-TKI)如吉非替尼、厄洛替尼顯示了空前的優(yōu)越性，多項(xiàng)研究證實(shí)對(duì)于EGFR突變陽性患者可予EGFR-TKI作為一線治療［4］。靶向藥物拉帕替尼是一種可逆性EGFR和HER-2雙受體阻斷劑，臨床試驗(yàn)證明其對(duì)多種實(shí)體腫瘤有明顯的抑制作用［5］。因此，EGFR和HER-2作為分子靶標(biāo)在 NSCLC治療中的作用日漸突出。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性的膜受體，能與相應(yīng)配體如表皮生長因子(EGF)及TGF-α結(jié)合形成二聚體，激活酪氨酸激酶活性，使自身酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，并能與下游含PTB和SH2區(qū)域的蛋白結(jié)合激發(fā)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)并促進(jìn)細(xì)胞分化、生長、遷移、黏附等。EGFR不但具有調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖分化的作用，還是腫瘤細(xì)胞增殖、分化和抗凋亡過程中的重要調(diào)節(jié)因子，其異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成［6，7］，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且在30%～70%的NSCLC組織中過表達(dá)，尤其是非吸煙、女性、肺腺癌患者［8］。本研究顯示，EGFR蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且與NSCLC病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。證實(shí)EGFR與NSCLC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究未發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白表達(dá)與NSCLC分化程度、TNM分期及患者年齡、性別、吸煙情況有關(guān)，可能與樣本量小有關(guān)。HER-2癌基因與EGFR同屬于表皮生長因子家族，所編碼的跨膜糖蛋白是一種具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞膜受體，能與相應(yīng)配體結(jié)合后形成同源性二聚體或異源性二聚體，并通過激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸磷酸化參與細(xì)胞的信號(hào)傳遞過程，信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)通過激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終介導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、增殖和黏附。正常情況下，HER-2原癌基因能與其他表皮生長因子受體結(jié)合，通過復(fù)雜的信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化;受到某些致癌因素的作用后，HER-2的蛋白結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控失常，可促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并通過阻止腫瘤細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腫瘤新血管生成等途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移［9，10］。研究［11］表明，HER-2 在人類許多腫瘤組織中有異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程密切相關(guān)，而且還使細(xì)胞的惡性度增加。本研究結(jié)果顯示，HER-2蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且與NSCLC的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。證實(shí)HER-2蛋白高表達(dá)與NSCLC的浸潤轉(zhuǎn)移及進(jìn)展密切相關(guān)，有望成為評(píng)價(jià)肺癌轉(zhuǎn)移和判斷腫瘤進(jìn)展的重要分子生物學(xué)指標(biāo)之一。

EGFR參與正常的細(xì)胞生長、分化和修復(fù)，在無活性狀態(tài)下以每個(gè)HER單體的形式存在，與相應(yīng)配體結(jié)合后促使其形成同源二聚體或異源二聚體。許多腫瘤發(fā)生與EGFR突變、過表達(dá)等導(dǎo)致的受體激活有關(guān)。EGFR和HER-2是生長因子家族中最活躍、最受矚目的受體，也是NSCLC組織中的主要合作受體，原因可能為激活的含有HER-2的異源二聚體復(fù)合物比含有其他HER家族成員的復(fù)合物在細(xì)胞表面更穩(wěn)定、更具侵襲力［12］。Pidaparthi［13］采用多元分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中EGFR/EGFR和EGFR/HER-2是最常見的二聚體形式。HER-2具有增強(qiáng)配體誘導(dǎo)的受體激活、增加并延長信號(hào)傳導(dǎo)通路、增強(qiáng)配體與受體的親和力、減少配體自同族的HER成員中分離的作用，且EGFR/HER-2與同源二聚體比較有更強(qiáng)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移作用［14］。本研究顯示，NSCLC組織中EGFR、HER-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。推測兩蛋白可能通過形成EGFR/HER-2異源二聚體參與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展，且二者之間的相互作用具有導(dǎo)致腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的傾向。由于本研究的病例數(shù)量有限，且檢測方法、操作程序及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)有不足之處，上述結(jié)論尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，EGFR、HER-2蛋白在NSCLC組織中呈高表達(dá)，兩者可能協(xié)同參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。

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