宋 敏，孫亞瓊，張 莉，潘 瓊

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院，鄭州450052)

結直腸癌是三大常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者就診時已經處于晚期，失去了手術治療的最佳機會。臨床試驗證明，西妥昔單抗、帕尼單抗等表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑治療轉移性結直腸癌的療效較常規(guī)化療顯著提高，但只有KRAS野生型患者從中受益［1，2］。KRAS對抗 EGFR 治療的預測作用已經明確，但其與臨床特征、預后之間的關系無明確結論。而關于BRAF基因的研究相對較少，雖被報道與抗 EGFR 耐藥相關［1，3］，但其突變狀態(tài)與病情及預后的關系尚無定論。2010年1月～2013年12月，我們觀察了結直腸癌組織KRAS和BRAF基因突變情況，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇結直腸癌組織477例，均經甲醛固定、石蠟包埋，患者均未行抗EGFR(西妥昔單抗/帕尼單抗)治療。其中男295例，女182例;年齡27～81歲，平均51歲;結腸癌316例，直腸癌161例;具有分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、浸潤深度、TNM 分期等資料者分別為 473、209、373、366、362例。

1.2 方法

1.2.1 指標觀察方法 記錄腫瘤原發(fā)部位、大小、分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期，并隨訪至疾病進展或死亡，記錄無進展生存期(PFS)。

1.2.2 基因突變檢測 采用實時熒光PCR及多重PCR-STR法檢測KRAS基因外顯子2第12、13位密碼子的基因突變情況，其中315例同時檢測BRAF基因外顯子15的突變情況，并對擴增產物進行測序。按照DNA試劑盒(QIAGEN)說明提取石蠟標本基因組DNA，KEAS上游引物:5'-GGTACTGGTGGAGTATTTGATAG-3'，下游引物:5'-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3'，擴增長度248 bp;BRAF上游引物:5'-CTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'，下游引物:5'-GTGGAAAAATAGCCTCAATTCTT-3'，擴增長度211 bp。反應條件:初始變性95℃、5 min，95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共 45 個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃結束反應。PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳確定后，采用ABI Sequence Analyzer測序分析。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。率的比較采用χ2檢驗，PFS的比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KRAS、BRAF 基因突變情況 KRAS 基因突變率為24.5%(117/477)，其中單純 G12D突變50例、G12V突變29例、G12A突變11例、G13D突變17例、G13A突變9例，G12D聯(lián)合G12V突變1例。BRAF基因突變率為11.4%(36/315)，均為V600E突變。未檢測到同時發(fā)生KRAS與BRAF基因突變者，BRAF基因在KRAS基因野生型患者中的突變率為 14.2%(36/252)，KRAS基因在BRAR基因野生型患者中的突變率為22.6%(63/279)。

2.2 KRAS、BRAF基因突變與結直腸癌臨床因素的關系 左、右側結腸癌患者KRAS基因突變率分別為13.3%、36.4%，P=0.05。KRAS 基因突變型和野生型分別有69.2%、30.0%出現(xiàn)肝轉移(P＜0.01)，有 30.8%、32.5% 出現(xiàn)肺轉移(P ＞ 0.05)。KRAS基因在≥65歲患者中的突變率高于＜65歲者，P＜0.01。BRAF基因在男性、高分化、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期的突變率分別高于女性、中低分化、Ⅰ～Ⅱ期，P 均 ＜0.05。

表1 KRAS、BRAF基因突變與結直腸癌患者臨床因素的關系［例(%)］

2.3 KRAS、BRAF基因突變與PFS的關系 KRAS基因突變型的PFS為6.2個月，野生型為10.6個月，P＞0.05。BRAF基因突變型的PFS為10個月，野生型為8個月，P ＞0.05。

3 討論

KRAS是大鼠肉瘤原癌基因家族(RAS)的成員之一，在抑制腫瘤細胞凋亡及加速其增殖方面起著重要的作用。BRAF通過激活MAPK通路和抑制促凋亡因子 BIM，導致細胞異常增殖和分化。當KRAS或BRAF基因發(fā)生突變時導致EGFR下游通路的激活，從而產生抗EGFR耐藥。結合目前關于KRAS、BRAF基因突變狀態(tài)的研究結果，雖然證實KRAS野生型患者能從抗EGFR治療中獲益，但仍有相當數(shù)量患者對抗EGFR治療無效。KRAS基因狀態(tài)并不能篩選出所有抗EGFR治療有效人群，而BRAF基因突變檢測目前均與KRAS基因檢測同時進行，參考價值仍依賴于KRAS基因突變狀態(tài)，尚不能單獨作為預測因子。因此需要更有效、更多預測因子來確定更加精確地靶向治療有效人群，目前已有 TP53、PTEN 與 PIK3CA、E-cadherin、NRAS 等相關因子的研究，但均未得出定論，希望更多的學者能在此研究方向得出更加精確的結論。

目前研究報道，KRAS突變率為20% ～45%［4～8］，BRAF 突變率為 4%～ 15%［9～15］，與本研究中KRAS(24.5%)和BRAF基因突變率(11.4%)基本一致。目前研究表明，KRAS、BRAF基因突變在女性、高級別腫瘤、右側腫瘤、老年患者中多見，并有報道顯示二者突變率在結腸癌中明顯高于直腸癌［8］。而本研究顯示，KRAS基因突變與老年顯著相關，BRAF基因突變則在男性中多見，以上差異可能是由于地域性、研究樣本量和基因檢測方法不同等導致的。此前報道中未曾發(fā)現(xiàn)KRAS基因同時多個密碼子突變，因此認為KRAS基因各密碼子突變?yōu)楠毩⑹录?。而本研究中觀察到1例KRAS基因同時發(fā)生G12D、G12V密碼子突變，可能系檢測誤差所致，但亦不能排除KRAS基因存在多種密碼子突變形式共存的可能性，有待后續(xù)觀察證實。本研究分析KRAS、BRAF基因突變狀態(tài)與患者預后之間的關系，認為基因突變患者肝轉移率較高;但未發(fā)現(xiàn)基因突變與PFS之間存在明顯關聯(lián)，表明KRAS與BRAF基因狀態(tài)并不能預測以奧沙利鉑/伊立替康為基礎治療的療效。

綜上所述，KRAS基因突變與結直腸癌患者的年齡、發(fā)病部位及肝轉移有關，BRAF基因突變與性別、分化程度、腫瘤TNM分期有關;檢測兩基因突變情況有助于判斷結直腸癌患者的病情。由于本研究患者均未行抗EGFR治療，所以未能觀察到兩基因突變對抗EGFR靶向治療的預測作用及其對預后的影響，有待進一步研究。

［1］De Roock W，Claes B，Bernasconi D，et al.Effects of KRAS，BRAF，NRAS，and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer:a retrospective consortium analysis［J］.Lancet Oncol，2010，11(8):753-762.

［2］Van Cutsem E，K?hne CH，Hitre E，et al.Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer［J］.N Engl J Med，2009，360(14):1408-1417.

［3］ Ling Y，Ying JM，Qiu T，et al.Detection of KRAS，BRAF，PIK3CA and EGFR gene mutations in colorectal carcinoma［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2012，41(9):590-594.

［4］Bokemeyer C，Van Cutsem E，Rougier P，et al.Addition of cetuximab to chemotherapy as first-line treatment for KRAS wild-type metastatic colorectal cancer:pooled analysis of the CRYSTAL and OPUS randomised clinical trials［J］.Eur J Cancer，2012，48(10):1466-1475.

［5］ Bokemeyer C，Bondarenko I，Makhson A，et al.Fluorouracil，leucovorin，and oxaliplatin with and without cetuximab in the firstline treatment of metastaticcolorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2009，27(5):663-671.

［6］Tveit KM，Guren T，Glimelius B，et al.PhaseⅢ trial of cetuximab with continuous or intermittent fluorouracil，leucovorin，and oxaliplatin(Nordic FLOX)versus FLOX alone in first-line treatment of metastatic colorectal cancer:the NORDIC-VⅡ study［J］.J Clin Oncol，2012，30(15):1755-1762.

［7］Maughan TS，Adams RA，Smith CG，et al.Addition of cetuximab to oxaliplatin-based first-line combination chemotherapy for treatment of advanced colorectal cancer:results of the randomised phase 3 MRC COIN trial［J］.Lancet，2011，377(9783):2103-2114.

［8］高靜，孫志偉，李艷艷，等.中國結直腸癌患者966例中KRAS和BRAF基因突變分析［J］.中華病理學雜志，2012，41(9):579-583.

［9］朱曉麗，蔡旭，張玲，等.中國結直腸癌患者中KRAS與BRAF基因突變特征及其臨床病理相關性［J］.中華病理學雜志，2012，41(9):584-589.

［10］Zhu XL，Cai X，Zhang L，et al.KRAS and BRAF gene mutations in correlation with clinicopathologic features of colorectal carcinoma in Chinese［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2012，41(9):584-589.

［11］Van Cutsem E，K?hne CH，Láng I，et al.Cetuximab plus irinotecan，flourouracil and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer:updated analysis of overall survival according to tumor KRAS and BRAF mutation status［J］.J Clin Oncol，2011，29(15):2011-2019.

［12］Gao J，Wang TT，Yu JW，et al.Wild-Type KRAS and BRAF Could Predict Response to Cetuximab in Chinese Colorectal Cancer Patients［J］.Chin J Cancer Res，2011，23(4):271-275.

［13］De Roock W，Claes B，Bernasconi D，et al.Effects of KRAS BRAF NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer:a retrospective consortium analysis［J］.Lancet Oncol，2010，11(8):753-762.

［14］Di Nicolantonio F，Martini M，Molinari F，et al.Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2008，26(35):5705-5712.

［15］Samowitz WS，Sweeney C，Herrick C，et al.Poor survival associated with the BRAF V600E mutation in microsatellite-stable colon cancers［J］.Cancer Res，2005，65(14):6063-6069.