王旭光，張 忠，王 瑩，張 珉，韓 瑩，潘曉蔚

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng)110034)

研究發(fā)現(xiàn)，遺傳易感基因的存在增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，特別是負(fù)責(zé)體內(nèi)解毒和修復(fù)DNA的基因。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶類(GSTs)是機(jī)體內(nèi)重要的Ⅱ相解毒酶，π類GSTs(GSTP1)是其中之一。有研究顯示，GSTP1不同基因型與乳腺癌、口腔癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤有關(guān)［1～3］。前期研究顯示，GSTP1第5外顯子不同基因型與胃癌發(fā)生前腸化生階段有關(guān)，在腸化生階段與幽門螺桿菌的感染存在著正交互作用［4，5］。但上述結(jié)果基于血清學(xué)研究，在組織學(xué)中該位點(diǎn)的不同基因型是否與胃癌有關(guān)，尚需要進(jìn)一步研究。本研究檢測(cè)胃癌組織中GSTP1第5外顯子基因型，探討其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年3月～2012年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、沈陽(yáng)奉天醫(yī)院和沈陽(yáng)第四人民醫(yī)院收治經(jīng)病理確診的胃癌患者216例(胃癌組)，男163例，女53例;年齡28～87歲，平均61.1歲。另選良性胃疾病患者300例作為對(duì)照組，包括中度慢性胃炎100例、重度慢性胃炎106例、萎縮性胃炎94例，其中男227例，女63例;年齡30～85歲，平均60.8歲。兩組年齡、性別均具有可比性(P均 ＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 對(duì)照組分別于患者的胃竇、胃角和胃體部胃鏡取活檢組織，胃癌組為術(shù)后標(biāo)本(取材部位同對(duì)照組)，經(jīng)95%乙醛或10%中性甲醛固定，石蠟包埋制作切片。每例標(biāo)本連續(xù)切10～12片，每片厚 5 μm。

1.2.2 GSTP1第5外顯子基因型檢測(cè) 采用PCRRFLP法。采用FFPE石蠟標(biāo)本DNA提取試劑盒提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增;上游引物5'-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3'，下游引物5'-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3';擴(kuò)增條件:95 ℃ 12 min，95 ℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，15個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min;16 ℃ 保存［4］。取 PCR 產(chǎn)物 2 μL，加限制性內(nèi)切酶 Alw26I 2 μL、NET緩沖液4 μL及去離子水配成20 μL體系，在37℃恒溫箱中酶切3 h，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，EB顯色10 min后觀察DNA條帶。依據(jù)文獻(xiàn)［6］分析胃癌的不同病理特征與GSTP1基因型的關(guān)系。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組基因型的比較采用χ2檢驗(yàn);GSTP1基因型與胃癌臨床病理特征的關(guān)系分析采用非條件Logistic回歸分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSTP1第5外顯子基因型檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)限制性內(nèi)切酶Alw26I酶切電泳后，GSTP1呈現(xiàn)3個(gè)不同條帶，具有329 bp和107/104 bp的為野生純合型AA，具有329 bp、222 bp和107/104 bp 3個(gè)條帶的為雜合突變型AG，具有222 bp和107/104 bp兩條帶為純合突變型GG。見(jiàn)圖1。

圖1 GSTP1第5外顯子不同基因型電泳圖

2.2 兩組GSTP1第5外顯子不同基因型比較 胃癌組AA基因型163例(75.5%)，AG基因型43例(19.9%)，GG 基因型10例(4.6%);對(duì)照組 AA 基因型248例(82.7%)，AG基因型45例(15%)，GG基因型7例(2.3%);胃癌組 AG+GG基因型比例為24.5%，高于對(duì)照組的17.3%(P ＜0.05)。

2.3 GSTP1第5外顯子基因型與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 胃癌組AG+GG基因型比例在高分化組低于中、低分化組，在腸型胃癌組織中低于彌漫型胃癌組織，在＞50歲人群中的比例高于≤50歲人群，P均＜0.05;而性別、大體分型、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)均與基因型無(wú)關(guān)(P均＞0.05)。見(jiàn)表 1、2。

3 討論

據(jù)2012年統(tǒng)計(jì)，我國(guó)胃癌發(fā)病率為36.21/10萬(wàn)［7］。胃癌的發(fā)生與外界環(huán)境因素和內(nèi)在遺傳因素密切相關(guān)。近年來(lái)，人們?cè)谘芯凯h(huán)境致胃癌的基礎(chǔ)上，更關(guān)注其內(nèi)在的遺傳特性(即遺傳易感性)。研究發(fā)現(xiàn)，許多基因的變異與胃癌的關(guān)系密切，包括細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)調(diào)控基因(Cyclin D1、Fas等)、修復(fù)基因(XRCC1等)、癌基因和抑癌基因(Ras、p53 等)、黏蛋白及黏附分子基因(MUC1、E-cadherin等)及細(xì)胞因子基因(IL-1β、IL-10、IL-8 等)的變異，特別是具有解毒功能的代謝酶基因(CYP2E1、GSTT1、COX-2 等)［8～12］。

表1 GSTP1基因型與胃癌臨床病理特征的關(guān)系［例(%)］

表2 GSTP1基因型與胃癌分化程度和Lauren分型關(guān)系的分層分析結(jié)果

GSTs在1961年由Booth首先發(fā)現(xiàn)，可分為兩類:一類是膜結(jié)合型家族，以微粒體為代表;另一類是細(xì)胞型家族，包含 6種，即 α(GSTA1～GSTA4)、μ(GSTM1～ GSTM5)、π (GSTP1)、θ(GSTT1 和GSTT2)、ζ(GSTZ1)和 ω［13］。編碼這些基因的多態(tài)性決定著這些酶的功能，特別是GSTP1基因第5外顯子1 587對(duì)堿基處A→G，導(dǎo)致異亮氨酸(Ile)-105→纈氨酸(Val)，從而使其氨基酸的體積和疏水性發(fā)生改變，影響其熱穩(wěn)定性，降低解毒功能。

GSTP1基因是代謝酶基因中的一種，就該基因變異與胃癌關(guān)系的研究結(jié)果顯示，胃癌組AG+GG基因型的比例高于對(duì)照組，提示G等位基因的突變是胃癌發(fā)生的原因之一。其機(jī)制可能為GSTP1基因發(fā)生突變后，熱穩(wěn)定性發(fā)生改變，進(jìn)而影響其功能，導(dǎo)致人體解毒功能不足，大量毒物進(jìn)入體內(nèi)，最終可能進(jìn)一步導(dǎo)致其他基因變化，進(jìn)而發(fā)生胃癌。有研究顯示，生理狀態(tài)下GSTP1所編碼的蛋白質(zhì)(GSTP-pi)是以二聚體形式存在，并和C-JUN、JNK相結(jié)合形成復(fù)合物，當(dāng)有毒物入侵時(shí)，GSTP-pi從復(fù)合物中解離，發(fā)揮解毒功能，同時(shí)釋放 C-JUN和JNK［14］。C-JUN和JNK是與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因，是否二者的激活進(jìn)一步導(dǎo)致胃癌的發(fā)生，尚需深入研究。

本研究結(jié)果顯示，GSTP1第5外顯子基因型變異與胃癌患者性別及胃癌直徑、大體分型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)。而＞50歲胃癌患者AG+GG基因型比例高于≤50歲者，提示＞50歲的GSTP1第5外顯子基因型變異者可能更易發(fā)生胃癌。胃癌的發(fā)生是致癌因素長(zhǎng)期累積的結(jié)果，GSTP1基因變異，使這些致癌物更易累積，特別是＞50歲的人群，機(jī)體無(wú)法對(duì)抗其制毒作用，導(dǎo)致胃腺體更易發(fā)生癌變。高分化組AG+GG基因型比例低于中、低分化組，提示GSTP1突變的個(gè)體更易發(fā)生分化較低的胃癌。前期免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在高分化胃癌組織中GSTP-pi表達(dá)高于中、低分化胃癌，特別是在低分化胃癌中GSTP-pi幾乎不表達(dá)，推測(cè)GSTP1突變可能導(dǎo)致其蛋白表達(dá)和解毒能力降低，使胃癌去分化現(xiàn)象更加顯著，惡性度更高。Lauren分型結(jié)果顯示，腸型胃癌患者AG+GG基因型的比例低于彌漫型胃癌，提示GSTP1變異增加彌漫型胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

總之，GSTP1第5外顯子AG和GG基因型與胃癌患者年齡、胃癌的組織分化程度及Lauren分型有關(guān)，而與患者性別和胃癌大體分型、癌腫直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移等無(wú)關(guān)。從GSTP1第5外顯子基因型突變?yōu)榍腥朦c(diǎn)，進(jìn)一步分析其上游和下游的調(diào)控因子的變化，有望找出胃癌內(nèi)在的發(fā)病因素和機(jī)制。

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