胡立群，徐慶國*，胡龍興，傅金民*

(1湖南農業(yè)大學農學院，長沙410128;2中國科學院武漢植物園，武漢430074)

結縷草是世界多個國家和我國的一種重要暖季型草坪草種質資源，它具有發(fā)達的匍匐莖和地下根狀莖，繁殖能力強，并且，還具有植株密度大、耐踐踏、再生性強、質地優(yōu)良、成坪較快、抗性強等優(yōu)點，因而廣泛應用于運動場和園林綠化草坪。目前國內外城市普遍面臨水資源供給短缺問題，草坪節(jié)水已經成為草坪業(yè)亟待解決的課題。同時我國長江中下游廣大地區(qū)具有冬冷夏熱、四季溫差較大的氣候特點，如何提高暖季型草坪草的抗寒性，延長其綠色期，也越來越受到人們關注。要解決結縷草應用中的節(jié)水與耐寒問題，通過選育抗旱性與抗寒性強的結縷草新品種無疑是一種很好的方法。

氨基酸是構成蛋白質的基本單元，種類繁多，目前從生物體內已檢測出的氨基酸多達180余種［1］。氨基酸與結縷草抗逆性密切相關。前人研究發(fā)現(xiàn)，結縷草在干旱脅迫下會積累脯氨酸［2～4］。對結縷草低溫脅迫生理變化的研究表明，低溫脅迫下的結縷草脯氨酸含量均表現(xiàn)積累趨勢［5～7］。但是，目前對于結縷草逆境條件下氨基酸代謝的生理響應研究多局限于脯氨酸的滲透調節(jié)作用，對于其它氨基酸則較少涉及。本研究利用氣相色譜—質譜聯(lián)用儀(GC－MS)，測定野生結縷草品系WZG43和WZG133在低溫和干旱脅迫下多種游離氨基酸含量變化，以便更深入了解結縷草的氨基酸逆境響應機制，為培育抗寒性和抗旱性強的結縷草新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)方法

本研究供試材料來源于中國科學院武漢植物園草坪種質資源組從全國各地收集的野生草坪草苗圃。2013年3月下旬從苗圃中挑選出2份原生境不同的野生結縷草，分別為WZG43與WZG133，然后置于直徑15 cm的塑料盆中培養(yǎng)(目的是將結縷草試驗材料從匍匐莖狀態(tài)培養(yǎng)成直立莖，以便于后續(xù)試驗的開展)，盆內栽培基質為1∶1的河沙與泥炭土混合物。培養(yǎng)環(huán)境為封閉式玻璃溫室，培養(yǎng)期間每2 d澆水一次，每10 d澆一次Hoagland營養(yǎng)液，視材料生長狀況對其進行修剪以促進分蘗，確保得到足夠多的試驗材料。供試材料的原生境情況如表1。

表1 供試結縷草材料的原生境情況Table 1 The original habitat conditions of tested Zoysia materials

1.2 脅迫處理方法

2013年6月7日將塑料盆中培養(yǎng)的供試結縷草取出，用水將根部泥土洗凈，然后將根部置于用錫箔紙完全包裹(防止瓶內Hoagland營養(yǎng)液中綠藻瘋長從而影響對結縷草的養(yǎng)料供給)的錐形瓶內，瓶內的培養(yǎng)基質為1/2Hoagland營養(yǎng)液。瓶口用保鮮膜包裹的衛(wèi)生紙條密封，以保證瓶內有足夠的空氣進入且最大限度減少瓶內水分的損失。每種結縷草各培養(yǎng)18瓶，共計36瓶。

供試結縷草于錐形瓶中培養(yǎng)15 d后，各挑選出適應營養(yǎng)液培養(yǎng)較好的6瓶，于2013年6月21日開始進行脅迫處理。每種材料分干旱、低溫兩種脅迫處理方式。其中干旱脅迫處理采用1/2 Hoagland營養(yǎng)液配制質量分數(shù)為20%PEG的溶液模擬，并將干旱脅迫材料置于人工氣候箱內。氣候箱溫度與光照設置分別為晝/夜:28/25℃、14/10 h。低溫脅迫采用溫度4±0.5℃的人工氣候箱模擬，其光照設置與干旱脅迫一致。各供試結縷草的干旱與低溫脅迫處理材料均重復3次，共計12瓶。

1.3 取樣方法

分別于脅迫處理第0(對照)、11、19 d各取樣一次。取樣部位為供試結縷草莖頂端第二至第三片完全展開功能葉，取樣植株為隨機選取。用萬分之一天平準確稱取樣品質量，取樣總質量視具體測定指標而定。各供試結縷草材料的各氨基酸含量均重復取樣測定3次，結果取平均值。

1.4 氨基酸測定與數(shù)據(jù)分析方法

采用GC－MS測定各氨基酸含量，具體步驟如下:

(1)游離氨基酸的提取。將鮮葉樣品0.100 g置于研缽中，迅速加入液氮研磨至粉末，將粉末移至2 mL離心管內，加入1.4 mL80%甲醇后于200 r/min、室溫下振蕩提取2 h;加入20 μL2 mg/L核糖醇和50 μL2 mg/L正十九酸甲脂，渦旋10 s后置于70℃金屬浴15 min，期間每5 min渦旋1次;然后于12 000 r/min、20℃下離心5 min。將上述上清液轉移至10 mL離心管內，加入750 μL氯仿、1.5 mL超純水，渦旋 15 s，再于 8 000 r/min、20℃下離心 15 min［8］。

(2)衍生化。取上一步離心好的極性相300 μL置于2 mL進樣瓶內，在真空濃縮儀(900 rpm、30℃)中干燥6 h，然后加入80 μL20 mg/mL鹽酸甲氧胺，渦旋15 s，于室溫、200 r/min震蕩2 h;再加入50 μL硅烷化試劑 MSTFA，渦旋15 s，于 37℃、200 r/min震蕩 2 h［9］。

(3)初級代謝產物測定。利用 The Agilent 7890A/5975C氣相色譜—質譜聯(lián)用系統(tǒng)進行測定。氣相色譜和質譜條件為:載氣為氦氣(99.999%)，流速1 mL/min，進樣不分流模式，進樣量1 μL，升溫程序為 70℃ 保持 5 min，以 5℃/min速率升至300℃，保持10 min，下次進樣前70℃平衡1 min;此外，電子轟擊(electron impact)離子源，電子能量70 eV，進樣口溫度280℃，柱箱溫度290℃，離子源溫度230℃，掃描速度0.6 scan/s，溶劑延遲時間4 min，質量掃描范圍(m/z)為30 ～650［10］。

(4)初級代謝產物鑒定及數(shù)據(jù)分析。采用Agilent ChemStation 2011版軟件以全掃描方式分析代謝產物。軟件中選取RTE積分器對各波峰進行智能積分，利用NIST2011代謝譜庫鑒定糖類代謝產物，再使用AMDIS GC/MS Analysis 2.70進行雜質及非氨基酸類物質剔除［11］。對各氨基酸導出數(shù)據(jù)中選取波形積分面積與內標物面積相比，使用Excel 2007對比值進行整理并作圖分析，采用SPSS19.0對比值作差異性分析。

2 結果與分析

2.1 結縷草的氨基酸代謝產物鑒定結果

利用GC－MS技術，采用NIST2011代謝譜庫及AMDIS GC/MS Analysis 2.70軟件，對結縷草葉片的氨基酸代謝產物進行指認，在結縷草 WZG43與WZG133葉片內共檢測出14種氨基酸，各氨基酸代謝產物的鑒定結果詳見表2。

表2 兩種結縷草葉片內氨基酸類代謝產物的鑒定結果Table 2 The identification result on amino acid metabolites in leaves of two lines of Zoysia

2.2 低溫與干旱脅迫對結縷草游離氨基酸的影響

本研究結果顯示(圖1)，結縷草 WZG43和WZG133所含14種游離氨基酸在低溫與干旱脅迫條件下的含量均呈不同程度的顯著積累趨勢，其中各氨基酸含量在干旱脅迫下的積累幅度均顯著低于低溫脅迫的積累幅度。低溫與干旱脅迫前，結縷草WZG43和WZG133葉片內的各氨基酸含量各不相同，其中以天冬酰胺含量最高，異亮氨酸含量最低。WZG43和WZG133的某些氨基酸含量也存在差異，其中WZG43的丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺含量顯著小于WZG133的各相應氨基酸含量，而其余氨基酸含量不存在顯著差異。

如圖1所示，低溫與干旱脅迫至11 d時，與脅迫前相比較，結縷草WZG43和WZG133在低溫與干旱脅迫下的各氨基酸含量均有不同程度增加，其中，在干旱脅迫下的各氨基酸含量的增加幅度均顯著小于低溫脅迫下各氨基酸含量的增加幅度。并且，結縷草WZG43和WZG133在低溫或干旱相同脅迫條件下的各氨基酸含量也存在明顯差異，WZG43干旱脅迫下的異亮氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺含量顯著大于WZG133的各相應氨基酸含量;WZG43干旱脅迫下的甘氨酸、蘇氨酸、天門冬氨酸、天冬酰胺含量與WZG133的各相應氨基酸含量無顯著差異;WZG43干旱脅迫下的其余氨基酸含量則顯著小于WZG133的其余氨基酸含量。低溫脅迫下，WZG43的丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸含量顯著大于WZG133的各相應氨基酸含量;WZG43和WZG133的天門冬氨酸含量無顯著差異;WZG43的其余各氨基酸含量均顯著小于WZG133的其余各氨基酸含量。

如圖1所示，低溫與干旱脅迫至19 d時，與脅迫11 d時相比較，結縷草WZG43和WZG133葉片內各氨基酸含量在干旱脅迫下均顯著升高;而低溫脅迫下的氨基酸含量變化則表現(xiàn)各異，其中，丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸含量顯著下降，其余氨基酸含量變化則表現(xiàn)為無顯著差異或者呈顯著增加。WZG43和WZG133在低溫或者干旱不同脅迫下的各氨基酸含量變化表現(xiàn)各異，其中，WZG133干旱脅迫下的蘇氨酸、丙氨酸含量和WZG43的纈氨酸含量顯著大于其低溫脅迫的各相應氨基酸含量;WZG43和WZG133干旱脅迫下的其余氨基酸含量均顯著低于低溫脅迫下的其余氨基酸含量。WZG43和WZG133在低溫或者干旱相同脅迫下的各氨基酸含量也表現(xiàn)各異，WZG43干旱脅迫下的纈氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺含量顯著高于WZG133的各相應氨基酸含量;WZG43和WZG133的谷氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺含量則無顯著差異，而WZG133的其余氨基酸含量則均表現(xiàn)為顯著高于WZG43的其余氨基酸含量。WZG43低溫脅迫下的丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺含量顯著大于WZG133的各相應氨基酸含量;WZG43低溫脅迫下的其余各氨基酸含量均顯著低于WZG133的其余各氨基酸含量。

圖1 低溫、干旱脅迫下結縷草葉片各氨基酸含量的變化Fig.1 The changes of amino acid content in leaves of Zoysia japonica under drought or cold stress

3 討論

積累游離氨基酸是植物逆境響應的一種重要方式，大量研究表明，植物在低溫或干旱脅迫下其游離氨基酸呈現(xiàn)積累趨勢［12～15］。目前對植物氨基酸逆境生理作用多傾向于其滲透調節(jié)，其中脯氨酸已經研究得比較清楚［5～7］。植物積累脯氨酸能力與其耐脅迫能力有一定相關關系，這在多年前就已得到證實［16］。本 研 究 結 果 顯 示，結 縷 草 WZG43 和WZG133在低溫或干旱脅迫下的14種氨基酸含量均有積累趨勢，其中低溫脅迫誘導的氨基酸積累幅度顯著大于干旱脅迫的積累幅度，表明4℃低溫脅迫給結縷草帶來的傷害遠大于20%PEG模擬的干旱脅迫帶來的傷害。結縷草WZG43和WZG133在低溫與干旱脅迫下的脯氨酸呈現(xiàn)一定程度的積累趨勢，其中WZG43低溫脅迫下的脯氨酸積累幅度顯著高于WZG133的脯氨酸積累幅度，這表明WZG43的耐寒性比WZG133強。

天冬酰胺是第一種從植物體內分離出來的氨基酸，它存在于大多數(shù)蛋白質中。脅迫條件下，植物積累脯氨酸的同時，天冬酰胺也得到一定程度積累。Cariloo等［17］研究了鹽脅迫對硬粒小麥硝酸還原酶的影響，結果顯示天冬酰胺呈現(xiàn)積累態(tài)勢。Stewart等［18］在論述植物積累氨基酸和相關代謝產物與脅迫環(huán)境間的關系時指出，天冬酰胺可能具有脯氨酸類似的逆境調節(jié)作用。而Lea等［19］指出，這可能只是從側面表明逆境抑制了植物體內蛋白質的合成。本研究結果顯示，兩個結縷草WZG43和WZG133在低溫或干旱脅迫下天冬酰胺含量均呈顯著積累趨勢，其中低溫脅迫下天冬酰胺含量的積累幅度顯著高于干旱脅迫的積累幅度，表明結縷草響應低溫或干旱脅迫的重要策略是積累天冬酰胺，以此進行滲透調節(jié)，并進一步說明了低溫脅迫比干旱脅迫對結縷草可能造成了更大的損傷。

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