基于IL－3及G－CSF的玉屏風散調(diào)控變應性鼻炎肥大細胞活性的實驗研究

張仲林，鐘玲，凌保東，袁明勇＊

（1.成都醫(yī)學院，成都 610083；2.四川省高校結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物重點實驗室，成都 610083）

白細胞介素－3（interleukin－3，IL－3）又稱多重集落刺激因子（multi－CSF），主要是由活化的T細胞所產(chǎn)生。IL－3生物學活性廣泛，具有刺激肥大細胞和漿細胞生長等作用［1］。粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G－CSF）主要由內(nèi)毒素、TNF－α和IFN－γ可活化單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，具有促進巨噬細胞及噬酸性細胞的多種功能，能抑制肥大細胞的增值［2］。本研究鎖定IL－3和G－CSF在肥大細胞方面的相反作用，以變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）為研究對象，從實驗角度探討中醫(yī)經(jīng)方玉屏風散對AR的雙向調(diào)節(jié)作用及其機制，為中醫(yī)臨床提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±10）g，由四川醫(yī)學科學院動物中心提供（合格證號：SCXK川2008－24），于自然光線、自由飲水攝食條件下，在成都醫(yī)學院藥理動物實驗室適應性喂養(yǎng)1w后備用。

1.1.2 實驗藥物 富馬酸酮替芬（國藥準字：H20103410，由浙江南洋藥業(yè)生產(chǎn)；規(guī)格：1mg／片）；玉屏風散藥液由成都醫(yī)學院中藥藥劑學國家中醫(yī)藥科研二級實驗室制備，生藥含量2g／mL。

1.1.3 實驗試劑 卵清白蛋白（美國Sigma公司），氫氧化鋁干粉 （西安化學試劑廠）。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（均由美國Gibco公司提供），鼠抗β－actin多克隆抗體（美國 Abcam 公司），IL－3、GMSCF試劑盒（美國R＆D Systems公司產(chǎn)品）購自武漢博士德生物工程有限公司，羊抗兔IL－3、GM－SCF二抗均由深圳市科潤達生物工程有限公司提供。

1.1.4 主要儀器 RM2016切片機（德國Leica有限公司）；2PJ－1展片機（天津天利航空機有限公司）；101－2A型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BioTek Synergy4酶標儀（香港Gene Company有限公司）；PowerPac Basic電泳儀（美國Bio－Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物配制 用蒸餾水將酮替芬配制成0.46 g／mL的濃度備用，玉屏風散分別配制成1.2g／mL、0.6g／mL及0.3g／mL高、中、低3個劑量組的濃度備用。

1.2.2 造模及給藥方法 將卵白蛋白0.3mg輔以氫氧化鋁30mg作佐劑，加生理鹽水l mL形成混懸致敏液，備用。健康SD大鼠隨機分為空白組、模型組、16%酮替芬組、120%、60%及30%的玉屏風散劑量組共6組，每組10只。除空白組外，其余大鼠均腹腔注射，1次／d，連續(xù)3d，為基礎致敏。后再用0.5%卵白蛋白的生理鹽水攻擊雙鼻腔，每側(cè)5 μL，每日1次，共6次，第7次攻擊后觀察30min，參照文獻［3］擬定評分標準記錄并評分，包括噴嚏、搔抓、流涕等過敏癥狀。從造模第1天開始，除空白組外，各組分別給予生理鹽水、16%酮替芬10mL／kg、120%、60%和30%的玉屏風散灌喂大鼠，給藥時間為7d至實驗結(jié)束。

1.2.3 觀察方法 1）過敏癥狀的觀察：參照文獻擬定的評分標準記錄并評分，包括噴嚏、搔抓、流涕等過敏癥狀；并計算各組總評分值。2）鼻腔灌洗液IL－3及G－SCF含量測定：大鼠于第10次激發(fā)后5h以100mg／kg氯胺酮和2mg／kg甲苯噻嗪腹腔注射麻醉。大鼠固定于仰臥頭低位，持續(xù)低負壓抽吸收集鼻腔灌洗液，離心，用RPMI1640培養(yǎng)，percoll梯度分離，制備細胞懸液，用PBS液洗吹，鏡下計數(shù)，調(diào)細胞濃度，按照說明書采用ELISA雙抗夾心法檢測IL－3及 G－SCF含量。3）鼻黏膜IL－3及 GSCF的表達檢測：末次給藥后45min，脫頸椎處死大鼠，剖取鼻黏膜，勻漿，3 000r／min離心10min，取上清液－20℃凍存，取出標本并按照說明書采用Westernblot法檢測IL－3及 G－SCF含量。4）吉姆薩染色法：切片經(jīng)脫蠟至蒸餾水，切片在微波爐內(nèi)解凍8min，蒸餾水迅速浸洗1min；1%冰醋酸水溶液浸洗2min，蒸餾水迅速浸洗；59%乙醇脫水5min，純乙醇脫水4min；二甲苯透明2次，各5min。中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠過敏癥狀觀察情況

模型組大鼠中出現(xiàn)AR發(fā)作癥狀，不同程度地表現(xiàn)為噴嚏、流涕、搔抓鼻部等表現(xiàn)。玉屏風散治療后大鼠表現(xiàn)癥狀的程度較同期模型組明顯減弱，約5～10min后癥狀開始緩解，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）（見表1）。

表1 末次給藥45min后激發(fā)大鼠鼻部癥狀積分情況（±s）

表1 末次給藥45min后激發(fā)大鼠鼻部癥狀積分情況（±s）

與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n 劑量／（g／mL） 過敏癥狀計分空白對照組10 － 0.00±0.00模型對照組 10 等體積蒸餾水 8.11±0.48酮替芬對照組 10 0.46 4.16±0.58＊＊玉屏風散高劑量組 10 1.2 5.07±0.46＊＊玉屏風散中劑量組 10 0.6 6.86±1.13＊玉屏風散低劑量組10 0.3 8.01±0.46

2.2 大鼠鼻腔灌洗液IL－3及G－SCF含量比較

與空白對照組比較，模型組大鼠NLF中IL－3和GM－SCF含量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；用玉屏風散治療后，IL－3和 GM－SCF含量均明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）（見表2）。

表2 ELSIA法檢測大鼠鼻腔灌洗液IL－3及GM－CSF含量（±s）

表2 ELSIA法檢測大鼠鼻腔灌洗液IL－3及GM－CSF含量（±s）

與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n 劑量／（g／mL） IL－3／（pg／mL） GM－SCF／（ng／mL）空白對照組 10 等體積蒸餾水2 140.8±120.35 58.7± 4.78模型對照組 10 － 3 850.6±150.45ΔΔ94.8± 5.44ΔΔ酮替芬組 10 0.46 2 095.7±127.41＊＊55.5± 3.12＊＊玉屏風散高劑量組 10 1.2 2 860.4±135.67＊＊64.5± 4.49＊＊玉屏風散中劑量組 10 0.6 3 085.8±149.65＊70.6±10.16＊玉屏風散低劑量組 10 0.3 3 756.9±108.32 75.2± 6.07＊

2.3 大鼠鼻黏膜IL－3及G－SCF的表達情況比較

大鼠鼻黏膜蛋白印跡表達顯示：與空白對照組比較，模型組IL－3及GM－SCF表達水平明顯降低，且差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；經(jīng)玉屏風散治療處理后，二者表達量水平明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）（見圖1、圖2）。

圖1 玉屏風散對AR大鼠鼻腔灌洗液IL－3及GCSF表達的影響

2.4 大鼠鼻黏膜吉姆薩染色結(jié)果

鏡下可見模型組胞漿呈紫藍色，肥大細胞數(shù)量最多，背景淡藍色，凋亡細胞為深藍色；而空白組胞漿呈紫藍色，肥大細胞數(shù)量比模型組少；經(jīng)玉屏風散高劑量組和酮替芬治療后肥大細胞數(shù)目顯著減少（見圖3：A～D）。

3 討論

圖2 玉屏風散對AR大鼠鼻腔灌洗液IL－3及G－CSF表達的灰度值比較

AR是由IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應性疾病，特應性個體在接觸致敏原后由IgE介導的介質(zhì)（主要是組胺）釋放，并有多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病。IL－3可促進巨噬細胞分化、增殖以及l(fā)a抗原表達，從而增強巨噬細胞遞呈抗原的能力，可與IL－6、EPO、GM－SCF等多種細胞因子協(xié)同作用［4］。忻耀杰等［5］研究證實，在AR中血清IL－3在嗜酸性粒細胞（EOS）的募集及功能活化，促進AR的形成和發(fā)展發(fā)病機制中起重要作用。李濤等［6］研究表明，AR大鼠鼻黏膜中IL－3mRNA表達水平明顯升高，藥物干預后顯著下降。GM－CSF是對樹突狀細胞（dendritic cells，DC）調(diào)節(jié)作用最強的細胞因子，它不僅能促進DC因子分化與增殖、維持其固有的細胞活力，而且對DC因子在體內(nèi)的分布和對各種抗原提呈功能都有重要作用［7］。成熟 DC能影響輔助 性 T 細胞（Helper T cells，Th），誘導Thl反應，調(diào)節(jié)Thl／Th2的比例，使Th0向Thl偏移分化，是治療AR反應的一種途徑。體內(nèi)GM－SCF水平升高能間接地影響Th亞群Th1與Th2的平衡狀態(tài)，從而有利于AR過敏癥狀的改善和治療［8，9］。GM－CSF能夠上調(diào)肥大細胞PARs表達，而PARs又可引起信號級聯(lián)反應，從而影響MCs的形態(tài)、分泌、活化，從而最終引起MCs的脫顆粒及釋放其內(nèi)預先合成的組胺等炎性介質(zhì)，導致AR的鼻癢、噴嚏和流涕等一系列過敏癥狀［10］。

圖3 各組鼻黏膜吉姆薩染色結(jié)果

本研究證實，造模后模型組大鼠過敏癥狀計分顯著升高，用玉屏風散治療后其噴嚏、流涕、搔抓等鼻部過敏癥狀計分明顯降低，且與模型組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。ELSIA法檢測顯示：造模后模型組大鼠鼻腔灌洗液IL－3及G－SCF含量顯著降低，用玉屏風散治療后其含量均明顯升高，且與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot法檢測顯示：造模后模型組大鼠鼻黏膜IL－3及G－SCF蛋白表達量顯著降低，用玉屏風散治療后其含量均明顯升高，且與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。吉姆薩染色顯示：與空白組比較，造模后模型組大鼠鼻黏膜中藍色的肥大細胞數(shù)量明顯增多，用玉屏風散治療后其數(shù)量顯著減少?？梢?，玉屏風散能有效提高肥大細胞的生長因子IL－3表達而抑制肥大細胞的增值因子G－CSF表達。

綜上所述，玉屏風散能通過激活肥大細胞生長因子IL－3、抑制促進肥大細胞增值因子 G－CSF，對肥大細胞進行雙向調(diào)節(jié)，從而穩(wěn)定肥大細胞活性，抑制其脫顆粒減少炎性介質(zhì)的釋放，從而改善AR的過敏癥狀，達到治療AR的目的。玉屏風散雙向調(diào)節(jié)肥大細胞活性的詳細分子機制還有待今后進一步深入研究和闡釋。

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