TLR4對胃癌細胞放射敏感性的影響探討

吳進盛

（儋州市農(nóng)墾那大醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，儋州 571700）

放療是治療惡性腫瘤的主要臨床手段，多數(shù)專家認(rèn)為，腫瘤細胞對放射線產(chǎn)生耐受性是影響腫瘤放療療效的主要原因［1］，因此，提高腫瘤細胞放射敏感性是目前臨床研究的熱點。近幾年大量文獻報道［2］證 實，Toll樣 受 體 4（Toll－like receptor 4，TLR4）和其他類型TLR在各種腫瘤組織中均有廣泛表達，具有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展、增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移以及免疫逃逸等多方面生物學(xué)效應(yīng)［3］，因此，腫瘤放療敏感性可能與TLR4表達有緊密聯(lián)系。本研究對小鼠胃癌細胞中TLR4表達與放射敏感性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

將小鼠成纖維細胞株NIH3T3（上海研域生物科技有限公司）和小鼠胃癌細胞株MFC（上海研域生物科技有限公司）分別進行體外低糖DMEM完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)［4］和體外高糖RPIM－1640完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)［5］。取對數(shù)生長期 MFC細胞，分為脂多糖（LPS）組、瑞沙托維（TAK－242）組和空白對照組。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 LPS組MFC細胞照射前4h加入濃度為1μg／mL的 LPS（美國sigma公司）；TAK－242組照射前1h加入濃度為1μg／mL的TAK－242（上海研域生物科技有限公司）；空白對照組只加入磷酸緩沖液（PBS）。3組 MFC細胞及NIH3T3細胞均使用 X.S.S.205（FZ）型固定式 X射線深部治療機進行5Gy照射和0Gy照射（以下均稱假照）。照射條件：單次高劑量照射5Gy，源靶距56cm，劑量率0.387Gy／min［6］。

1.2.2 細胞生物學(xué)檢測 采用流式細胞術(shù)（FCM）檢測MFC細胞TLR4表達，TLR4試劑盒（上海研域生物科技有限公司）；CCK－8法檢測MFC細胞增殖活性（日本同仁化學(xué)研究所上海代表處）；克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性（anti－spindlin1／SPIN－2上海信裕生物科技有限公司）；FCM檢測細胞凋亡和周期，細胞凋亡與周期檢測試劑盒（上海研域生物科技有限公司）。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察NIH3T3細胞與MFC細胞經(jīng)5GyX射線照射前后TLR4表達情況，并比較LPS和TAK－242對X射線照射前后MFC細胞增殖活性、放射敏感性、凋亡率和周期的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細胞經(jīng)5GyX射線照射前后TLR4表達

NIH3T3細胞經(jīng)5GyX射線照射24h后TLR4表達水平有所下降，但與假照比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射24h后TLR4表達水平顯著下降，與假照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 腫瘤細胞經(jīng)5Gy X射線照射前后TLR4表達

2.2 LPS和TAK－242對X射線照射前后MFC細胞增殖活性、放射敏感性和凋亡率影響

MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射后增殖活性、放射敏感性顯著下降，凋亡率顯著升高，與假照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；假照條件下，MFC細胞經(jīng)TLR4阻斷劑TAK－242和激動劑LPS處理后增殖活性、放射敏感性和凋亡率發(fā)生顯著升高或降低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；5Gy照射條件下，MFC細胞經(jīng)TLR4阻斷劑TAK－242處理后，增殖活性顯著升高；經(jīng)激動劑LPS處理后放射敏感性和凋亡率發(fā)生顯著升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。

2.3 LPS和TAK－242對X射線照射前后MFC細胞周期影響

MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射后，G0／G1期和S期細胞顯著下降，G2／M期細胞顯著升高，與假照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；假照條件下，MFC細胞經(jīng)TLR4阻斷劑TAK－242處理后，G0／G1期顯著下降、G2／M期顯著升高；經(jīng)激動劑LPS處理后，S期顯著升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。

表2 LPS和TAK－242對X射線照射前后MFC細胞增殖活性、放射敏感性和凋亡率影響

表3 LPS和TAK－242對X射線照射前后MFC細胞周期影響

3 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，是臨床治療的一大難題。目前治療惡性腫瘤的方法主要有手術(shù)、放療和化療，其中接受放療的患者所占比例較高［7］。本研究選擇小鼠胃癌細胞株MFC作為研究對象，通過與小鼠正常組織來源的成纖維細胞株NIH3T3進行比較，觀察MFC細胞對TLR4的表達情況，并比較照射后MFC細胞增殖活性、放射敏感性、凋亡率和周期的變化以及激動劑LPS和阻滯劑TAK－242對MFC細胞放射敏感性的影響［8］。結(jié)果顯示，與NIH3T3比較，MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射24 h后TLR4表達水平下降，表明MFC受照后TLR4為低表達。

增殖活性是細胞生命活動的重要特征，是細胞活性的直觀反應(yīng)［9］。腫瘤細胞受到輻射后，細胞表面膜受體產(chǎn)生細胞保護性通路和毒性通路兩種信號傳導(dǎo)，前者參與細胞的抑制增殖，后者參與細胞的凋亡［10］。本研究中MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射后增殖活性顯著下降，表明MFC細胞經(jīng)X射線照射后增殖活性被抑制。MFC細胞經(jīng)激動劑LPS和阻滯劑TAK－242處理后，增殖活性顯著上升或下降，表明激動劑LPS和阻滯劑TAK－242能夠?qū)FC細胞增殖活性產(chǎn)生刺激或抑制效果。

細胞放射敏感性的檢測方法為細胞克隆形成實驗［11］，MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射后存活分?jǐn)?shù)顯著下降，經(jīng)激動劑LPS和阻滯劑TAK－242處理后顯著上升或下降。另外，MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射后凋亡率顯著升高，經(jīng)LPS和TAK－242處理后凋亡率顯著上升或下降。結(jié)果表明，TLR4與腫瘤放射敏感性和凋亡率緊密相關(guān)。

腫瘤細胞周期的調(diào)節(jié)主要通過G1期阻滯實現(xiàn)［12］，M期后部分細胞轉(zhuǎn)入G0期即處于阻滯，從而脫離細胞周期，暫時停止分裂；部分繼續(xù)分裂完成周期循環(huán)［13］。X線照射可導(dǎo)致腫瘤細胞DNA損傷，從而引起細胞周期延遲，細胞受損后發(fā)生G1期和G2期阻滯，能夠修復(fù)的細胞可進入下一周期，不能修復(fù)的細胞則被清除［14］。本研究中，MFC細胞經(jīng)5Gy X射線照射后，G0／G1期顯著下降，G2／M期顯著升高，細胞周期發(fā)生較大改變。

總體來看，MFC細胞受5Gy X射線照射后增殖活性、放射敏感性、凋亡率和周期均產(chǎn)生顯著改變，TLR4表達受到影響，而受到激動劑LPS和阻滯劑TAK－242刺激后，TLR4表達又發(fā)生顯著升高或下降。由此可見，腫瘤細胞的TLR4表達與放射敏感性有緊密聯(lián)系，且可受到激動劑和阻滯劑刺激后發(fā)生顯著改變。

綜上所述，TLR4可對MFC細胞放射敏感性產(chǎn)生較大影響，MFC細胞對TLR4的低表達主要受增殖活性、放射敏感性、凋亡率和細胞周期影響。

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