EPO修飾增強Müller細(xì)胞對RCS大鼠視網(wǎng)膜變性的干預(yù)效果

李宗義 李鵬 高芙蓉 范氏雪幸 張敬法 王方 呂立夏 徐國彤

遺傳性和老年性的視網(wǎng)膜變性疾?。╠egenerative retinal diseases,DRD）是目前全球性的重要致盲原因，嚴(yán)重影響著眾多患者的生活。經(jīng)過多年努力，盡管對個別類型DRD的認(rèn)識和治療有所進(jìn)展，比如對年齡相關(guān)性黃斑變性（agerelated macular degeneration）中濕性AMD的抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）治療取得初步效果[1-2]，但對這類疾病來講，不論是對干性AMD還是視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）或是其他類型的DRD，總體上還缺少有效的治療方法[3-5]?，F(xiàn)有治療方法的研究主要集中在藥物治療、基因治療以及與包括干細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞治療等方法。

研究表明，多種神經(jīng)營養(yǎng)因子有保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活的作用[6-8]。其中，促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO）對視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護作用受到越來越多的重視。有研究表明，EPO具有血管保護作用[9-11]。本實驗室的前期研究工作證明：在糖尿病大鼠玻璃體腔內(nèi)注射hEPO，可以通過抗凋亡途徑保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元、視網(wǎng)膜血管細(xì)胞以及視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）細(xì)胞[12-13]，并且通過負(fù)反饋抑制低氧誘導(dǎo)因子-1alpha（Hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）的表達(dá)，從而降低VEGF、iNOS和內(nèi)源性EPO的水平，進(jìn)而減輕視網(wǎng)膜組織水腫而引起的視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元損傷[14]，改善患者視力?；谶@些研究結(jié)果，筆者提出，EPO對視網(wǎng)膜神經(jīng)元和血管的保護作用也可能會在AMD等視網(wǎng)膜變性疾病中有干預(yù)治療效果。鑒于EPO的半衰期短，反復(fù)注射有引起視網(wǎng)膜脫離、出血、炎癥反應(yīng)等多種并發(fā)癥的可能[15]，筆者進(jìn)一步采用腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus,AAV）為載體攜帶EPO基因，在糖尿病大鼠中實驗EPO基因治療。結(jié)果顯示，這種基因治療能有效延長EPO的治療效果，使EPO治療視網(wǎng)膜疾病更為簡單、安全[16]。

除分泌細(xì)胞因子外，細(xì)胞治療的另一個目的和主要干預(yù)機制是利用供體細(xì)胞或其分化及轉(zhuǎn)分化產(chǎn)生的細(xì)胞去取代或修復(fù)受損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)元或其他細(xì)胞。在神經(jīng)視網(wǎng)膜中，Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中最主要的一種膠質(zhì)細(xì)胞，在視網(wǎng)膜正常生理活動以及病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。Müller細(xì)胞貫穿整個視網(wǎng)膜，與神經(jīng)元及血管細(xì)胞廣泛密切接觸，并可分泌多種因子為視網(wǎng)膜提供營養(yǎng)物質(zhì)并幫助視網(wǎng)膜排出代謝廢物[17]，為其作為細(xì)胞載體提供可能。同時，有研究表明，Müller細(xì)胞是神經(jīng)視網(wǎng)膜組織中具有干性的細(xì)胞[14]，在神經(jīng)視網(wǎng)膜發(fā)育或損傷修復(fù)過程中有重要作用。

基于EPO保護視網(wǎng)膜細(xì)胞的作用和Müller細(xì)胞可能的干性及旁分泌功能，本研究利用RCS大鼠視網(wǎng)膜變性模型探討兩者結(jié)合使用時對視網(wǎng)膜變性的干預(yù)及其機制，旨在研發(fā)hEPO修飾的Müller（hEPO-Müller）細(xì)胞干預(yù)視網(wǎng)膜退行性病變的治療方法。

材料與方法

一、材料

RCS大鼠：由同濟大學(xué)動物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)并提供。胰蛋白酶、磷酸緩沖液（PBS）、細(xì)胞培養(yǎng)基及部分添加成分均購自Gibco/Invitrogen公司；TriZOL購自于Takara Bio公司；胎牛血清（FBS）及部分細(xì)胞培養(yǎng)添加成分購自Hyclone公司；ReverTra-Ace mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TIANGEN公司；熒光封片劑Flurorescence Mounting Medium為DAKO公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）、多聚甲醛（PFA）、細(xì)胞核染料DAPI等均購自Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)皿、孔板及15ml、50ml刻度塑料離心管購自BD/Corning公司。Anti-EPO、Anti-GFAP購自Abcam；Anti-Actin抗體為Sigma產(chǎn)品；Anti-Recoverin抗體購自Millipore公司。Taq酶購自天根生化科技（北京）有限公司。

二、方法

1.Müller細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：大鼠Müller細(xì)胞系由Vijay Sarthy（Northwestern University,Evanston,IL）提供，在含10﹪FBS，1﹪青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用LipofectAMINETM 2000 分別將EPO-PPYCAGIP和GFP-PPYCAGTP轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的大鼠Müller細(xì)胞系。通過1 μg/ml嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達(dá)GFP或hEPO的Müller細(xì)胞系。

2.RCS大鼠視網(wǎng)膜組織的體外培養(yǎng)：將出生后21d的RCS大鼠脫頸處死后，剝離獲得視網(wǎng)膜組織并在不同條件下培養(yǎng)。實驗分為五組，將視網(wǎng)膜組織分別與完全培養(yǎng)基、含Müller細(xì)胞裂解液的完全培養(yǎng)基、添加hEPO的完全培養(yǎng)基、Müller細(xì)胞及hEPO-Müller細(xì)胞培養(yǎng)/共培養(yǎng)，每兩天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。兩周后收集視網(wǎng)膜組織，用4﹪PFA固定后進(jìn)行包埋和切片。

3.細(xì)胞準(zhǔn)備：單層培養(yǎng)，到細(xì)胞融合度達(dá)到80﹪時用0.25﹪胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞后終止。經(jīng)70 μm孔徑細(xì)胞濾網(wǎng)（cell dtrainer,BD）過濾去除細(xì)胞團和雜質(zhì)，計數(shù)后離心收集，以5×105cells/μl重懸于PBS。

4.細(xì)胞移植：將出生后21d RCS大鼠麻醉后，置于體式顯微鏡下，并在大鼠眼球上放置凹透鏡；用30 gauge針頭在角鞏膜緣后2 mm處刺一個針孔，然后用裝有33 gauge針頭的微量注射器從針孔處進(jìn)針至視網(wǎng)膜下腔，注入3μl（含3×105細(xì)胞）懸液。

5.冰凍切片免疫熒光染色分析：將細(xì)胞移植后不同時間的RCS大鼠脫頸處死并立即取出眼球置于4﹪多聚甲醛中固定，4℃放置1h。將眼球解剖獲得視杯后用組織包埋劑OCT于4℃平衡1h，液氮中包埋并保存于-80℃。用冰凍切片機連續(xù)切8 μm厚的組織片，于室溫用電風(fēng)扇吹2～3 h后，用PBS洗去OCT后，加入0.25﹪ Triton X-100并置于室溫透膜10min。用PBS洗去透膜液3次，每次5min。用3﹪ BSA/PBS于室溫封閉切片30min。用封閉液稀釋一抗至適當(dāng)濃度，去除封閉液加一抗，4℃過夜。用PBS洗去一抗，洗3次，每次5min。加熒光二抗并置室溫反應(yīng)1h后，用PBS洗去二抗，洗3次，每次5min。以DAPI處理5min標(biāo)記細(xì)胞核后，用封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察并照相或置于4 ℃暗室中保存。

6.hEPO酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：將GFP-Müller和hEPO-Müller培養(yǎng)在6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞長至80﹪的融合度時，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h并收集培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的hEPO的水平反應(yīng)了細(xì)胞分泌的hEPO的量。根據(jù)試劑盒的說明書檢測培養(yǎng)基中hEPO的濃度。

7.RT-PCR：視網(wǎng)膜組織經(jīng)TriZOL（Takara Bio公司）抽提獲得RNA，進(jìn)一步經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶（Takara Bio公司）反轉(zhuǎn)成cDNA，用Taq酶進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)檢測。所用PCR引物序列見表1。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SigmaPlot 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。體外將視網(wǎng)膜組織分別與完全培養(yǎng)基、含Müller細(xì)胞裂解液的完全培養(yǎng)基、添加hEPO的完全培養(yǎng)基、Müller細(xì)胞及hEPO-Müller細(xì)胞培養(yǎng)/共培養(yǎng)兩周后視網(wǎng)膜組織的內(nèi)核層與外核層的厚度測量值表示為，且外核層與內(nèi)核層平均厚度在不同處理條件下的比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR引物序列

結(jié) 果

一、構(gòu)建hEPO-Müller細(xì)胞和GFP-Müller細(xì)胞系

本研究應(yīng)用的hEPO-Müller細(xì)胞系和作為對照和示蹤的GFP-Müller細(xì)胞系均獲成功。如圖1所示，通過轉(zhuǎn)染獲得的GFP-Müller細(xì)胞呈綠色熒光陽性（圖 1a,b），而 hEPO-Müller細(xì)胞為綠色熒光陰性（圖1c,d）。RT-PCR和Western blot檢測也證明GFP-Müller細(xì)胞表達(dá)GFP，不表達(dá)hEPO；hEPO-Müller細(xì)胞表達(dá)hEPO，不表達(dá)GFP（圖2 a，b）。鑒于EPO是一種分泌蛋白，筆者也對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行EPO檢測以進(jìn)一步確定hEPO轉(zhuǎn)染的結(jié)果。在兩種細(xì)胞生長融合度達(dá)到80﹪左右，分別取培養(yǎng)1d后的培養(yǎng)液并利用ELISA檢測hEPO含量。結(jié)果顯示，hEPO-Müller細(xì)胞的培養(yǎng)液中的hEPO達(dá)到900 mIU/ml，而GFPMüller細(xì)胞培養(yǎng)液中未能檢測到hEPO(圖2c)。因此，本實驗通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法得到了穩(wěn)定表達(dá)GFP和hEPO的Müller細(xì)胞系。

圖1 GFP- Müller細(xì)胞系和hEPO-Müller細(xì)胞系的構(gòu)建

圖2 GFP- Müller細(xì)胞系和hEPO-Müller細(xì)胞系的鑒定

二、hEPO-Müller細(xì)胞對體外培養(yǎng)的RCS大鼠視網(wǎng)膜病變的干預(yù)作用

RCS大鼠的RPE細(xì)胞由于酪氨酸激酶受體Mertk基因突變而失去特異性識別并吞噬光感受器細(xì)胞脫落外節(jié)（Outsegment,OS）的功能，最終將導(dǎo)致光感受器細(xì)胞死亡[18]，是廣泛使用的視網(wǎng)膜變性的動物模型。為研究Müller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞對視網(wǎng)膜變性的干預(yù)作用，筆者將RCS大鼠視網(wǎng)膜組織分離并在體外與hEPO或Müller細(xì)胞共培養(yǎng)。兩周后，組織學(xué)檢測5個實驗組的視網(wǎng)膜組織的外核層（ONL）與內(nèi)核層（INL）的平均厚度的統(tǒng)計結(jié)果表明，在作為對照組的完全培養(yǎng)基以及含有Müller細(xì)胞裂解液的完全培養(yǎng)基組，視網(wǎng)膜核層厚度明顯變薄，其厚度分別為內(nèi)核層（15.19±7.08）μm，外核層（13.87±8.60）μm 和內(nèi)核層（15.94±1.77）μm，外核層（24.81±3.03）μm 的厚度。相比之下，hEPO、Müller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞都能一定程度上保護視網(wǎng)膜核層的厚度，兩核層的厚度分別在hEPO組為（23.03±3.29）μm，（33.92±7.59）μm ；Müller組為（24.81±2.02）μm，32.15±3.03 μm ；hEPO-Müller組為（32.40±8.35）μm，(40.25±3.29)μm（n=3）；并以hEPO-Müller組厚度增加最為顯著（P均 < 0.05,圖 3）。

圖3 不同條件下培養(yǎng)的RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層（ONL）與內(nèi)核層（INL）厚度的比較

三、hEPO-Müller細(xì)胞移植后在RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔的存活情況

圖4 RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔移植GFP-Müller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞操作示意圖及移植確認(rèn)

供體細(xì)胞移植后在受體組織中的存活是細(xì)胞治療能獲得成功的重要條件，本研究中將GFPMüller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞注射到生后21d的RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔（圖4a）1d后，取眼球制備冰凍切片標(biāo)本并染色檢查時，可觀察到呈現(xiàn)綠色熒光的GFP-Müller細(xì)胞堆積在視網(wǎng)膜下腔（圖4b,c）。注射后2周和4周檢查，視網(wǎng)膜下腔綠色熒光依舊存在。表明本實驗構(gòu)建的GFP-Müller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞可以通過視網(wǎng)膜下腔注射的方法進(jìn)行移植，并能在視網(wǎng)膜下腔中存活。

四、hEPO-Müller細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植后未發(fā)生膠質(zhì)化改變

應(yīng)用Müller細(xì)胞治療的主要風(fēng)險是其膠質(zhì)化改變，有報道說Müller細(xì)胞的膠質(zhì)化會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變，并且膠質(zhì)化形成的瘢痕也會影響視網(wǎng)膜組織的修復(fù)[19]。因此，筆者檢查移植后的Müller細(xì)胞的膠質(zhì)化情況，以確定這些細(xì)胞是否適合用于細(xì)胞移植治療。如圖5所示，與未做處理或假處理的RCS大鼠視網(wǎng)膜相比，接受GFP-Müller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞移植的大鼠視網(wǎng)膜的膠質(zhì)化的標(biāo)志基因GFAP和Vimentin的表達(dá)都沒有明顯變化，表明本實驗中制備的GFP-Müller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞移植后不會引起受體大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜的膠質(zhì)化。

圖5 用RT-PCR檢測接受不同處理的RCS大鼠視網(wǎng)膜的GFAP和Vimentin（Vim）表達(dá)

圖6 免疫熒光染色檢測不同細(xì)胞移植對RCS大鼠視網(wǎng)膜核層的保護

五、hEPO-Müller細(xì)胞對RCS大鼠視網(wǎng)膜退行性病變的干預(yù)效果

未接受任何干預(yù)處理的RCS大鼠，在出生后7周時，視網(wǎng)膜ONL只有1～2層細(xì)胞還存活（圖6a）。在RCS大鼠出生后3周進(jìn)行GFP-Müller細(xì)胞移植，四周后（即出生后第7周），外核層存活細(xì)胞約2～3層，提示即使單純移植Müller細(xì)胞對視網(wǎng)膜變性也有一定延緩作用。在接受hEPOMüller細(xì)胞移植的大鼠，ONL中存活的細(xì)胞數(shù)目明顯增加，大約形成5～6層（圖6）。用免疫組化方法檢測光感受器細(xì)胞標(biāo)記物Recoverin時發(fā)現(xiàn)，盡管各組之間在視網(wǎng)膜厚度及核層數(shù)方面有明顯差異，接受GFP-Müller細(xì)胞和hEPO-Müller細(xì)胞移植的大鼠ONL與對照組大鼠的ONL相同，Recoverin染色均為陽性（圖7），表明細(xì)胞移植治療組中較厚的視網(wǎng)膜厚度和較多的細(xì)胞層數(shù)是供體細(xì)胞保護了ONL的光感受器細(xì)胞的結(jié)果，而不是移植的供體細(xì)胞的堆積，即hEPO-Müller細(xì)胞移植可以更好地干預(yù)視網(wǎng)膜核層的退行性病變，保護視網(wǎng)膜外核層。

圖7 免疫熒光染色法檢測經(jīng)不同細(xì)胞移植的RCS大鼠視網(wǎng)膜中Recoverin的表達(dá)情況

討 論

作為視網(wǎng)膜變性疾?。―RD）的主要代表，年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD），特別是干性AMD，是全球性重要致盲眼病之一。其發(fā)病機理尚不明確，也缺乏有效治療方法，更是醫(yī)學(xué)界的重要挑戰(zhàn)。像多種視網(wǎng)膜疾病的最終表型一樣，AMD發(fā)病到一定階段，也表現(xiàn)出視網(wǎng)膜神經(jīng)元的不可逆喪失。因此，大家對細(xì)胞移植治療寄予厚望，旨在用移植的供體細(xì)胞修復(fù)或者取代受損傷的視網(wǎng)膜細(xì)胞。目前研究中的供體細(xì)胞有胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）、間充質(zhì) 干 細(xì) 胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,以及視網(wǎng)膜祖/干細(xì)胞，包括睫狀體邊緣區(qū)（ciliary marginal zone,CMZ）細(xì)胞、Müller膠質(zhì)細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）等[20-21]。本研究選用Müller細(xì)胞作為供體細(xì)胞，結(jié)合hEPO進(jìn)行基因修飾，旨在通過Müller與視網(wǎng)膜神經(jīng)脊血管細(xì)胞廣泛聯(lián)系的特性，在細(xì)胞替代治療理念基礎(chǔ)上，把可分泌的細(xì)胞營養(yǎng)因子更廣泛地輸送到視網(wǎng)膜組織中。

在各種視網(wǎng)膜細(xì)胞中，Müller細(xì)胞在維持結(jié)構(gòu)、支持視網(wǎng)膜細(xì)胞和參與代謝等多方面發(fā)揮著重要作用。與各類視網(wǎng)膜神經(jīng)元相比，Müller細(xì)胞還具有更強的抵抗炎癥、低氧和損傷的能力[17]。最近的研究表明，在成人的神經(jīng)視網(wǎng)膜中分離出的Müller細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)會得到表達(dá)Sox2、Nestin和CHX10等標(biāo)記物的具備干性的Müller細(xì)胞[22]。因此，新的治療策略可以利用Müller細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療或?qū)üller細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為需要修復(fù)的受損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)元。此外，Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中唯一貫穿整個視網(wǎng)膜并與視網(wǎng)膜神經(jīng)元及血管細(xì)胞廣泛密切接觸的細(xì)胞，還具有分泌細(xì)胞因子及幫助視網(wǎng)膜排出代謝廢物的功能[17]。用這種細(xì)胞作為載體表達(dá)某個或某些用于治療的因子，有可能使治療的作用影響到更大的區(qū)域。在本研究中，與對照組相比，RCS大鼠的視網(wǎng)膜組織在體外與hEPO、Müller細(xì)胞及hEPO-Müller細(xì)胞共培養(yǎng)后，視網(wǎng)膜組織的INL與ONL厚度都一定程度上得到保護，并以hEPO-Müller細(xì)胞的保護效果更為顯著。這一現(xiàn)象在RCS大鼠體內(nèi)實驗中也得到了證實，表明Müller細(xì)胞對于視網(wǎng)膜退行性病變具有干預(yù)作用，而這種作用在移植同時表達(dá)EPO的Müller細(xì)胞時更為明顯。

EPO，也稱造血細(xì)胞因子，是一種多功能蛋白質(zhì)。在胎兒階段，主要產(chǎn)生于肝臟，而在成年人則主要有腎臟產(chǎn)生和分泌。在人的神經(jīng)視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)組織中都有EPO及其受體的表達(dá)[23]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，EPO具有保護神經(jīng)和血管的作用[8-10]。對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的研究表明，EPO能劑量依賴地促進(jìn)其神經(jīng)生長并對其有保護作用。在視網(wǎng)膜退行性病變的模型中，通過檢測光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)中EPO與EPO受體的相互作用，也證實全身使用EPO治療可以保護視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞、對抗光誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[24]。2008年，實驗室首次證明了眼內(nèi)注射EPO能在糖尿病大鼠模型中保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元和血管細(xì)胞，并保護大鼠的視功能[12]。在其后的研究中，筆者進(jìn)一步闡明了EPO的作用機制[13]并在初步臨床試驗中證實了EPO的這一作用[25]。基于這些研究，筆者預(yù)期EPO能在保護RCS大鼠視網(wǎng)膜中發(fā)揮作用，并可能會通過Müller細(xì)胞的持續(xù)分泌而更為有效。本研究的結(jié)果與實驗前的預(yù)期一致：在視網(wǎng)膜下腔移植治療中，hEPO修飾的Müller細(xì)胞可以延緩RCS大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的變性，并表現(xiàn)出比單純EPO注射和單純Müller細(xì)胞移植更強的治療作用。此外，本研究中，移植到視網(wǎng)膜下腔的供體細(xì)胞，其膠質(zhì)化標(biāo)志蛋白GFAP和Vimentin的表達(dá)在細(xì)胞移植組和對照組中無明顯差異，說明Müller移植不會促進(jìn)視網(wǎng)膜的膠質(zhì)化，為Müller細(xì)胞移植的安全性提供了一個側(cè)面的依據(jù)。

綜上所述，Müller細(xì)胞通過視網(wǎng)膜下腔注射可以減緩RCS大鼠視網(wǎng)膜退行性病變，經(jīng)hEPO修飾Müller對視網(wǎng)膜變性有更好的干預(yù)作用，并且不會發(fā)生膠質(zhì)化。因此，Müller可以作為一種細(xì)胞載體攜帶hEPO等營養(yǎng)因子用以治療視網(wǎng)膜變性，為視網(wǎng)膜退行性疾病的治療研究提供了一種新的方法。

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