小鼠角膜上皮祖細(xì)胞系TKE2的表型研究

瞿楊洛娃 林輝 耿志鑫 何卉 劉祖國(guó) 李煒

角膜上皮干細(xì)胞位于角膜緣上皮基底細(xì)胞層，是角膜上皮細(xì)胞再生的唯一來源，對(duì)維持正常眼表狀態(tài)具有重要作用。眼表化學(xué)傷、熱燒傷、Stevens-Johnson綜合征等疾病常導(dǎo)致角膜上皮干細(xì)胞缺乏，嚴(yán)重影響視力[1]。研究角膜上皮干細(xì)胞增殖與分化的機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)角膜上皮干細(xì)胞生理以及角膜上皮干細(xì)胞缺乏的病理生理過程具有重要意義。Kawakita等[2]從CD-1小鼠中成功分離培養(yǎng)出小鼠角膜上皮祖細(xì)胞系TKE2,并采用此細(xì)胞系成功構(gòu)建了組織工程角膜上皮，但該研究組沒有對(duì)TKE2細(xì)胞分化前后的細(xì)胞表型進(jìn)行深入觀察。本研究擬采用不同條件培養(yǎng)TKE2細(xì)胞，觀察TKE2增殖與分化狀態(tài)下的細(xì)胞表型變化，為研究角膜上皮干細(xì)胞生理與病理生理奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

小鼠角膜上皮祖細(xì)胞系TKE2由日本Keio大學(xué)Tetsuya Kawakita教授提供。主要試劑TrypLETMExpress Stable Trypsin Replacement Enzyme、KSFM無血清培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、鼠源性上皮生長(zhǎng)因子、雞抗兔Alexa Fluor 488抗體、雞抗羊Alexa Fluor 488抗體購自Invitrogen公司；DAB試劑盒、小鼠單克隆抗Ki67，P63，K10抗體購自DAKO公司；小鼠單克隆抗K14，K15，K16，PCNA抗體、羊多克隆抗K12、抗Connexin 43抗體購自Santa Cruze公司；ABC Kit、小鼠IgG購自Vectastain公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

利用低鈣無血清培養(yǎng)基KSFM培養(yǎng)TKE2細(xì)胞，待細(xì)胞融合70﹪～80﹪時(shí)，將TKE2細(xì)胞用1ml TrypLE Express酶37℃消化8min，觀察到細(xì)胞變圓后，加入2ml KSFM培養(yǎng)基，輕輕吹打細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液以1500 r/min離心5min，吸出上清液，用KSFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，記數(shù)，以500/cm2密度接種于8孔培養(yǎng)板里，在5﹪CO2及37℃條件下培養(yǎng)，每3 d換液1次，并進(jìn)行相差顯微鏡觀察，待細(xì)胞達(dá)到50﹪融合時(shí)，部分換用高鈣含血清培養(yǎng)基DMEM +10﹪FBS繼續(xù)培養(yǎng)2 d后終止培養(yǎng)，進(jìn)行免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)。

（二）細(xì)胞鑒定

1.形態(tài)學(xué)觀察：應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察TKE2細(xì)胞的大小，形態(tài)變化。

2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色：將TKE2細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗5min，4﹪多聚甲醛室溫下固定20min，PBS漂洗。利用0.6﹪ H2O2處理10min，PBS漂洗。0.2﹪Triton X100透膜20min，PBS漂洗，2﹪牛血清白蛋白封閉1h，然后加PCNA和Ki67抗體，4℃過夜。PBS漂洗后加二抗，利用DAB試劑進(jìn)行顯色。用PBS終止顯色反應(yīng)并漂洗，若無陽性反應(yīng)，則用蘇木素染細(xì)胞核，然后進(jìn)行梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

3.免疫細(xì)胞熒光染色：將TKE2細(xì)胞用PBS漂洗5min，4﹪多聚甲醛室溫下固定20min，PBS漂洗后加入0.2﹪TritonX100透膜20min，PBS漂洗后加入2﹪牛血清白蛋白封閉1h，加入ABCG2，P63，K14，K15，K16，K10，K12，Connexin43抗體，4℃過夜。漂洗后加1﹪牛血清白蛋白配制的二抗，孵育1h，PBS漂洗后加入DAPI封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

結(jié) 果

一、不同培養(yǎng)條件對(duì)TKE2細(xì)胞形態(tài)的影響

TKE2細(xì)胞在KSFM培養(yǎng)基中呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞體積小，形態(tài)均一(圖1a)。而當(dāng)細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基DMEM+10﹪ FBS中培養(yǎng)2 d，細(xì)胞明顯增大，并且有梭形細(xì)胞出現(xiàn)（圖1b）。

二、不同培養(yǎng)條件對(duì)TKE2細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)識(shí)物表達(dá)的影響

角膜上皮干細(xì)胞表達(dá)P63，PCNA，ABCG2，Ki67等蛋白[1,3]。在無血清培養(yǎng)基KSFM中培養(yǎng)的TKE2克隆內(nèi)所有細(xì)胞均呈P63，PCNA，Ki67,ABCG2的陽性染色，其中P63，PCNA和Ki67為胞核染色，ABCG2為胞漿染色（圖2a-d）。在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TKE2所有克隆內(nèi)細(xì)胞P63，PCNA，Ki67，ABCG2的染色為陰性(圖2f-g)。Connexin 43是角膜上皮細(xì)胞的分化標(biāo)志物，表達(dá)在角膜緣基底上層細(xì)胞中，基底細(xì)胞中沒有表達(dá)[4]。染色結(jié)果顯示，無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TKE2細(xì)胞均無Connexin 43染色 (圖 2e、j)。

圖1 不同培養(yǎng)條件對(duì) TKE2 細(xì)胞形態(tài)的影響

三、不同培養(yǎng)條件對(duì)TKE2細(xì)胞角蛋白表達(dá)情況的影響

角蛋白14（K14）是復(fù)層上皮具有有絲分裂活性的基底細(xì)胞的標(biāo)識(shí)物，表達(dá)于人、小鼠、大鼠角膜緣及中央角膜上皮的基底細(xì)胞中[5-6]。在本實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基KSFM中的TKE2的所有克隆內(nèi)細(xì)胞均呈K14陽性染色（圖3a），在小克隆中染色較強(qiáng)，在大克隆中周邊細(xì)胞的染色要強(qiáng)于中央細(xì)胞的染色，而在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TKE2克隆內(nèi)僅有少量細(xì)胞陽性染色(圖3f)。

角蛋白15（K15）表達(dá)在人和鼠角膜緣上皮的基底和基底上層細(xì)胞中，在鼠中央角膜上皮中K15沒有表達(dá)[5]。在培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基KSFM中的TKE2克隆中，K15表現(xiàn)為散在的陽性細(xì)胞著色(圖3b),在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TKE2克隆內(nèi)則沒有K15陽性細(xì)胞(圖3g)。

角蛋白16（K16）主要表達(dá)在復(fù)層上皮組織中有絲分裂能力的角化細(xì)胞中，標(biāo)識(shí)具有高度增殖能力和非正常分化的細(xì)胞[7-8]。在KSFM培養(yǎng)基中，K16表達(dá)于所有克隆內(nèi)，為克隆中央?yún)^(qū)片狀著染(圖3c),在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TKE2克隆內(nèi)，只有少量細(xì)胞呈K16陽性染色(圖3h)。

角蛋白12（K12）標(biāo)識(shí)終末分化的角膜上皮細(xì)胞，在正常角膜緣上皮基底細(xì)胞中沒有表達(dá)，而表達(dá)于角膜緣上皮基底上層細(xì)胞以及中央角膜上皮全層細(xì)胞[7]。角蛋白10（K10）則標(biāo)識(shí)分化后的表皮細(xì)胞，而在正常角膜緣及角膜上皮中沒有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TKE2細(xì)胞均不表達(dá) K12( 圖 3d，i) 和K10(圖 3e，j)。

圖3 不同培養(yǎng)條件對(duì)TKE2細(xì)胞角蛋白表達(dá)情況的影響

討 論

Kawakita等[2]成功從CD-1小鼠的角膜緣上皮細(xì)胞中分離出小鼠角膜上皮細(xì)胞，他們發(fā)現(xiàn)將這些細(xì)胞低密度（500/cm2）接種于無血清低鈣培養(yǎng)基KSFM可以形成均一的小細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳第4代時(shí)可以形成克隆，而形成的克隆生長(zhǎng)速度卻不相同，平均倍增時(shí)間為31.3 h，他們將一個(gè)倍增時(shí)間為34.2h的克隆中的細(xì)胞定義為TKE2細(xì)胞。這個(gè)細(xì)胞系中單個(gè)的細(xì)胞如以低密度接種于低鈣無血清KSFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，呈均一的小細(xì)胞形態(tài)，可形成克隆，克隆內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)P63，不表達(dá)K12及Connexin43。當(dāng)在低鈣無血清KSFM培養(yǎng)基中單純加入5﹪FBS，0.9mmol/L的Ca2+，以及同時(shí)加入兩者后，低密度接種的TKE2細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核變大，同時(shí)部分細(xì)胞失去P63陽性染色，而K12陽性細(xì)胞增多。因此，TKE2細(xì)胞在低鈣無血清KSFM培養(yǎng)基中可以維持角膜上皮干細(xì)胞的特性，而在高鈣或（和）含5﹪FBS的KSFM培養(yǎng)基中，TKE2可以分化成正常的角膜上皮細(xì)胞。

基于以前的報(bào)道，TKE2細(xì)胞有穩(wěn)定增殖和分化成角膜上皮細(xì)胞的能力，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察TKE2細(xì)胞在增殖和分化狀態(tài)下的角蛋白以及干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況。筆者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)于低鈣無血清培養(yǎng)基中的TKE2細(xì)胞呈P63陽性染色，K12、Connexin43陰性染色，在含有10﹪胎牛血清的DMEM(含1.8mmol/L Ca2+)中培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞明顯增大，有梭形細(xì)胞出現(xiàn)，P63轉(zhuǎn)為陰性，這與Kawakita在無血清培養(yǎng)基及高鈣含血清培養(yǎng)基（5﹪ FBS+ 0.9mmol/L Ca2+）培養(yǎng)的TKE2的表型相符合。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了其他細(xì)胞增殖及干細(xì)胞標(biāo)識(shí)物PCNA、Ki67、ABCG2的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)于低鈣無血清培養(yǎng)基KSFM中的TKE2細(xì)胞均為PCNA、Ki67、ABCG2陽性染色，而在加入10﹪FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 TKE2細(xì)胞的 PCNA、Ki67、ABCG2的染色均為陰性。但是在高鈣含血清培養(yǎng)后，K12、Connexin43、K10的表達(dá)仍為陰性，可見在本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)條件下，TKE2的增殖能力雖然已經(jīng)降低，但不能誘導(dǎo)其向角膜上皮方向或表皮方向分化。另外，TKE2細(xì)胞在反復(fù)體外傳代過程中，也可能失去了分化為正常角膜上皮細(xì)胞的能力。

K14、K15和K16均為表達(dá)在復(fù)層化上皮的重要角蛋白，參與細(xì)胞的增殖和遷移過程[9]。其中K14、K15可作為鑒定上皮干細(xì)胞及角膜緣干細(xì)胞表型的蛋白[4,10-11]，K16尤其表達(dá)在過度增生的上皮疾病組織中，如翼狀胬肉[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KSFM中培養(yǎng)的TKE2細(xì)胞呈K14陽性表達(dá)，K15為克隆內(nèi)散在細(xì)胞陽性著染，K16為克隆中央?yún)^(qū)片狀著染，說明擴(kuò)增的TKE2細(xì)胞群體中含有干細(xì)胞。誘導(dǎo)分化后，克隆內(nèi)只有少量細(xì)胞呈K14、K16陽性染色，K15則為陰性。進(jìn)一步說明了TKE2細(xì)胞在低鈣無血清培養(yǎng)基KSFM中培養(yǎng)可以保持其干性，而在含血清培養(yǎng)基中增殖能力下降，可能失去復(fù)層化能力。

筆者得出結(jié)論，在低鈣無血清培養(yǎng)基KSFM中培養(yǎng)的TKE2可以保持高度增殖能力，并表達(dá)角膜上皮干細(xì)胞常見標(biāo)識(shí)物，在這種條件下培養(yǎng)的TKE2可作為角膜上皮干細(xì)胞研究的工具。但由于在本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)體系中不能將TKE2誘導(dǎo)出表達(dá)K12的角膜上皮細(xì)胞，是誘導(dǎo)體系的原因還是TKE2細(xì)胞自身失去了分化成正常角膜上皮細(xì)胞的功能，還有待進(jìn)一步研究。后續(xù)研究也可通過改變誘導(dǎo)體系，比較不同體系中角膜上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白如K12、Pax6的表達(dá)情況，這也為我們研究角膜上皮細(xì)胞定向分化的機(jī)制提供了一個(gè)新的細(xì)胞模型。

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