雷榮 李娟 余天 張帆

1.武漢愛爾眼科醫(yī)院淚道科，湖北 武漢 430063；

2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院干細胞中心，湖北 武漢 430022；

3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430030

葡萄膜黑色素瘤是人眼內腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一［1］，90%來源于人眼脈絡膜［2］。隨著近年來診療水平的不斷提高，以保留眼球為前提的綜合治療已取得顯著的療效，其中放射治療是葡萄膜黑色素瘤最常用的方法之一［3］。近年發(fā)現(xiàn)的Omi/HtrA2是存在于線粒體膜間隙的前凋亡分子，在促凋亡信號誘導下，Omi/HtrA2由線粒體釋放到細胞質，并通過抑制凋亡蛋白抑制因子家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)、活化半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶途徑促凋亡［4］。早期生長反應基因1(early growth response-1，Egr-1)的調控序列中一段特定結構可感受細胞內外的理化刺激如自由基、電離輻射等［5］，繼而誘導下游基因表達。我們通過脂質體將pEgr1-HtrA2質粒轉染入葡萄膜黑色素瘤細胞系OCM-1，結合放射線干預(radiation treatment，RT)，誘導Omi/HtrA2表達，探討通過誘導基因殺傷治療葡萄膜黑色素瘤的可能。

1 材料和方法

1.1 質粒的構建

pIRES-Egr1(pEgr1)和pEgr1-HtrA2質粒根據(jù)孫教授等［6］的研究設計。pEgr1、pEgr1-H trA2和pCMV-HtrA2質粒由武漢晶賽公司構建、純化并鑒定。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染

人眼葡萄膜黑色素瘤OCM-1細胞本實驗室常規(guī)保存，培養(yǎng)條件：DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，添加10%胎牛血清(美國Hyclone公司)，100 kU/L青霉素-G，100 mg/L鏈霉素(美國Gibco公司)，在37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞接種于6 孔板，當細胞密度達到80%~90%時換成OPTI-MEM培養(yǎng)基，并用LipofectamineTM2000 (美國Invitrogen公司)分別轉染質粒pEgr1、pCMV-HtrA2和pEgr1-HtrA2，轉染步驟按說明書進行。轉染4 h后換液，改用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h用于相關指標檢測。在濃度為600 μg/mL G418中培養(yǎng)篩選出穩(wěn)定轉染的質粒。

1.3 放射條件

采用西門子直線加速器的X射線照射(6 MeV X射線，距離100 cm，2 Gy/min)。

轉染質粒的各組細胞培養(yǎng)48 h，給予不同劑量的放射照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于相關指標檢測。移植瘤的局部給予放射線照射，隔日1次，共3次。

1.4 實時定量PCR

用TRIzol(美國Invitrogen公司)法提取總RNA。將100~500 ng總RNA用cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)反轉錄合成cDNA。實時定量PCR在LightCycler(Roche)機器上運行，并用SYBR Green Real-time PCR Master Mix-Plus(日本TOYOBO公司)試劑盒。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。分別擴增HtrA2和內參GAPDH基因。HtrA2的上游引物為5’-CTAGCTAGCGCC ACCATGGCTGCGCCGAGGGC-3’，下游引物為5’-CGACGCGTTCATTCTGTGAC C T C A G G G G T C A C A-3’。G A P D H的 上 游 引 物 為5 ’ - G A A G G T G A A G G T C G G A G T C-3’，下游引物為5’-G A A G ATGGTGATGGGATTTC-3’。以GAPDH基因作為參照，利用ΔΔCT法計算相對變化量。

1.5 蛋白質印跡法(Western blot)檢測HtrA2蛋白表達量

收集各組細胞用R I PA 裂解液(加拿大ProMab生物公司)提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。分別將提取的各個樣品的50 μg蛋白行8%SDS-PAGE電泳。電轉移印跡到PVDF膜，封閉后，分別加入Omi/HtrA2小鼠抗人抗體(美國Abcam公司，1∶500)、β-actin克隆抗體(美國Abcam公司，1∶333)、溫育、洗滌、添加二抗(美國KPL公司，1∶3 000)。底物發(fā)光試劑盒SuperSignal蛋白質檢測試劑盒購自Pierce公司。以β-actin作為參照，相對計算條帶的灰度值。實驗至少重復3次。

1.6 克隆形成實驗

各組呈對數(shù)生長的單層細胞分別予以0、2、4、6、8、10 Gy劑量的X線照射。將各組照射后的細胞以適當數(shù)量接種到培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)2周后，固定，結晶紫染色細胞。在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)＞50個細胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI(美國Becton公司)雙標記法進行流式細胞儀分析細胞凋亡。胰蛋白酶消化法收集各組細胞，80%乙醇4 ℃過夜。染色標記根據(jù)說明書步驟進行后立即上流式細胞儀檢測。采用Cellq uest軟件分析。實驗重復3次。

1.8 動物實驗

OCM-1細胞(含1×107細胞的0.2 mL無菌0.9%NaCl溶液懸液)注射入裸小鼠的右后肢皮下制作移植瘤模型，腫瘤體積達300 mm3的小鼠用于下一步實驗。將移植瘤模型小鼠分為對照組、放射組、基因組以及基因放射組，每組10只?；蚪M和基因放射組移植瘤內注射pEgr1和pEgr1-HtrA2質粒(100 μL含20 μg質粒和40 μg LipofectamineTM2000的混合物)。放射組和基因放射組小鼠局部給予8 Gy和4 Gy照射，隔日1次，共3次。質粒分別從4個方向注入腫塊，防止泄漏。小鼠于無菌環(huán)境下飼養(yǎng)。腫瘤體積運用公式0.54×長(mm)×寬(mm)×高(mm)，電腦斷層掃描測量后計算。腫瘤體積每周測2次。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 不同X-ray劑量下HtrA2基因表達情況

將轉染pEgr1、pEgr1-HtrA2或pCMV-HtrA2質粒的各組細胞培養(yǎng)48 h，給予0、2、4、8和12 Gy不同劑量的放射照射。24 h后檢測HtrA2 mRNA表達。隨著放射劑量的增加，pEgr1-HtrA2組HtrA2 mRNA表達較照射前增加，呈劑量依耐性，4 Gy時顯著增加，在8 Gy時達到最高值，較照射前增加15倍(P<0.05)，pCMVHtrA2組HtrA2 mRNA表達較照射前輕度下降，與放射劑量無明顯關系，pEgr1組HtrA2 mRNA表達無明顯變化(P>0.05，圖1A)。Western blot檢測8 Gy照射后的各組細胞HtrA2蛋白表達情況。pEgr1-HtrA2組HtrA2蛋白較照射前明顯增加(P<0.05)，pCMV-HtrA2組HtrA2蛋白較照射前無明顯變化(P<0.05，圖1B)。結果顯示放射線能夠有效啟動Egr1以及其下游的基因表達。

2.2 HtrA2基因對放射敏感性的影響

檢測轉染不同質粒的OCM-1細胞在0、2、4、6、8和10 Gy不同劑量X射線照射后的克隆數(shù)，計算各組克隆形成率。可見pEgr1-HtrA2組和pCMV-HtrA2組隨放射劑量增加克隆形成率下降，且均較pEgr1組低(P<0.05，圖2)。說明轉染pEgr1-HtrA2質粒后可增強OCM-1細胞放射敏感性。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將轉染pEgr1、pEgr1-HtrA2或pCMV-HtrA2質粒的各組細胞培養(yǎng)48 h或給予8 Gy放射照射后培養(yǎng)24 h，Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞儀凋亡檢測。pEgr1-HtrA2聯(lián)合放射組和pCMVHtrA2聯(lián)合放射組細胞凋亡率分別為(40.2±5.9)%和(37.7±6.0)%，較pEgr1、pEgr1-HtrA2及pEgr1聯(lián)合放射組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。pCMV-HtrA2組與pCMV-HtrA2聯(lián)合放射組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3)。

圖1 qRT-PCR和Western blot法檢測HtrA2 mRNA和蛋白表達Fig.1 Detection of mRNA and protein expression of HtrA2 by qRT-PCR and Western blot

圖2 克隆形成實驗檢測細胞生存率Fig.2 Clonogenic survival after various doses of irradiation exposure

2.4 動物實驗

質粒分別注射入移植瘤模型局部后給予8或4 Gy的放射線照射，隔日1次，共3次，總劑量分別達24和12 Gy。定期記錄腫瘤體積。pEgr1-HtrA2聯(lián)合放射組第10天起腫瘤開始縮小，更長時間觀察未見腫瘤體積增大，在40 d時有5只小鼠的移植瘤縮小至觸摸不清，無法測量，與其他組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4A)。pEgr1和pEgr1-HtrA2組移植瘤快速生長，pEgr1聯(lián)合放射和單純放射組腫瘤早期暫時縮小，但從第20天開始迅速生長。

在pEgr1-HtrA2聯(lián)合4 Gy放射組長時間觀察未見移植瘤的體積增大，也未見腫瘤破潰、出血、結痂、死亡。30 d時1只實驗小鼠的移植瘤縮小至觸摸不清。在單純4 Gy照射組，腫瘤體積繼續(xù)增大(圖4B)。說明較低劑量放射線結合基因能夠達到抑制腫瘤生長的作用。

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡Fig.3 Detection of the apoptosis by fl ow cytometry

圖4 動物實驗中pEgr1-HtrA2聯(lián)合放射對葡萄膜黑色素瘤的影響Fig.4 Effects of pEgr1-HtrA2 gene therapy combined with radiation in vivo

3 討 論

腫瘤治療的腫瘤基因-放射治療是將經(jīng)射線誘導表達并對腫瘤具有殺傷作用的基因轉入腫瘤細胞，然后對腫瘤實施放療，同時誘導基因表達，通過射線和基因的雙重作用殺傷腫瘤，為解決腫瘤放療的不良反應開辟了新途徑［7］。Egr-1正是含有此類調控序列的基因的典型代表［8-9］，屬于立早基因家族，定位于5q31，mRNA全長310 bp，編碼543個氨基酸，其序列中含有多個保守的CarG結構域，這些結構域可感受細胞內外的理化刺激如自由基、電離輻射等，繼而誘導下游基因表達。Tsurushima等［10］將凋亡因子caspase-8與Egr-1啟動子構造成一完整質粒后用于治療惡性腦膠質瘤取得了滿意的療效，且效果可在時間和空間上受放射線調控。這種可控的基因放射治療使得放療的不良反應進一步降低，安全性進一步提高。

HtrA2是近年發(fā)現(xiàn)的一種前凋亡分子，在細胞內具有雙重作用：①該分子存在于線粒體中并參與線粒體的正常生理代謝；②在外界刺激條件下，它從線粒體釋放出來參與并促進細胞凋亡［11］。其途徑包括：能與IAPs特異性結合，解除IAPs對半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的阻抑而激發(fā)凋亡，依賴其本身的蛋白激酶活性促進細胞凋亡，此外，HtrA2還參與腫瘤細胞的失巢凋亡［12］和腫瘤壞死［13］。

本研究選用這種前凋亡分子與Egr-1啟動子成功構建pEgr1-HtrA2質粒，并與常規(guī)啟動子pCMV-HtrA2質粒和空白質粒pEgr1對比。分別轉染了上述3種質粒的OCM-1細胞在接受0、2、4、8、12 Gy劑量的放射線后，pEgr1-HtrA2組HtrA2 mRNA表達在8 Gy時達到高峰，我們認為可能Egr-1啟動子在8 Gy時已達到最大效率，在8 Gy前HtrA2表達隨放射劑量增加而增高，而pCMV-HtrA2組并無劑量依賴性。

總之，本實驗結果發(fā)現(xiàn)，轉染HtrA2前凋亡因子可在放射線作用下抑制葡萄膜黑色素瘤OCM-1細胞的生長，并在動物實驗中取得了滿意的效果。由Egr-1啟動子構建的pEgr1-HtrA2質粒依賴放射線調控，可減少放射線劑量，增強放射敏感性，同時也提高了局部放療的安全性。

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