岳冬梅 王林美 李樹英

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連 116024)

乳腺癌在我國發(fā)病率較高且近年來有逐漸增加的趨勢［1］，臨床上治療癌癥主要采用放療和化療，其手段除了殺傷腫瘤細胞以外，對人體的免疫系統(tǒng)也會造成很大的傷害，因而尋找療效好、副作用低的治療藥物是近年來科研工作者研究的熱點之一［2］。蛹蟲草菌寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹體上生成的一種蟲草混合體，隸屬真菌門(Eumycota;Mycobionta)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、麥角菌目(Clavicipitales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有補肺益腎等多種功效，是扶正祛邪的良藥之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，蛹蟲草主要通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能而發(fā)揮其生物學(xué)活性效應(yīng)［3－4］。遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所柞蠶產(chǎn)品研發(fā)實驗室成功地建立了以柞蠶蛹為宿主，大規(guī)模人工培育柞蠶蛹蟲草的技術(shù)體系［5－6］。檢測分析表明［7－10］，柞蠶蛹蟲草的化學(xué)成分、營養(yǎng)成分和藥用功能與冬蟲夏草非常相似，且蟲草素等主要活性物質(zhì)的含量高于野生冬蟲夏草。目前，用蛹蟲草治療惡性腫瘤的研究已有報道［11－12］，那么柞蠶蛹蟲草水提物(Aqueous extract from cordycep militaris of antheraea pernyi，AEo-APC)體外抑制人乳腺癌細胞MCF －7 增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用如何，我們對其進行了探討，試驗結(jié)果如下。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料:人乳腺癌細胞株MCF －7，由大連醫(yī)科大學(xué)細胞實驗室提供;柞蠶蛹蟲草，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所蟲草開發(fā)研究室培養(yǎng)提供。

主要試劑和儀器:RPMI － 1640 培養(yǎng)液，購自GIBCO 公司;胎牛血清，購自蘭州民海生物工程有限公司;二甲基亞砜(DMSO)，購自天津科密歐試劑公司;染色劑噻唑藍(MTT)，購自Sigma 公司。HERA cell 150 型CO2培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;SW－CJ－1F 型超凈工作臺，蘇州蘇凈集團產(chǎn)品;BIO －RAD 型酶標儀，奧地利Biocell 公司產(chǎn)品;LEICA DMI 3000 B 型相差倒置熒光顯微鏡，德國Leica 公司產(chǎn)品;JEM －1200EX 型透射電子顯微鏡，JEOL 公司產(chǎn)品;Anke TDL80 －2B 型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品產(chǎn)品;EPICS －XL 型流式細胞儀，COULTER 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 柞蠶蛹蟲草水提物的制備 取新鮮柞蠶蛹蟲草子實體100 g 加水1 000 mL，勻漿后置70 ℃水浴浸提12 h，2 000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 濾膜過濾除菌，即得水提物(鮮草子實體100 g/L)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細胞株MCF －7 從－196 ℃液氮中取出，采用參考文獻［13］中常規(guī)法復(fù)蘇，添加含10%胎牛血清的RPMI －1640 培養(yǎng)液(pH 7.2～7.4)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長狀態(tài)良好時進行傳代。

1.2.3 AEoAPC 對人乳腺癌細胞MCF －7 增殖的抑制試驗 采用MTT 比色檢測的方法［14］。MTT 配制:稱100 mgMTT 放入小燒杯中，加入20 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)，磁力攪拌30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。將對?shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF－7 配成濃度為1 ×105個/mL 的細胞液，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入190 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。待細胞貼壁后分別加入質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0 g/L 的AEoAPC 10 μL，并設(shè)置空白孔調(diào)零、無菌蒸餾水陰性對照(CK)，每個處理6個重復(fù)。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL。繼續(xù)孵育4 h 以后，每孔加入150 μL 二甲基亞砜溶解，室溫振蕩10 min，于全自動酶標儀檢測每孔的OD(490 nm)值，計算人乳腺癌細胞MCF－7 生長抑制率(Inhibitory rate，IR)。

1.2.4 人乳腺癌細胞MCF －7 形態(tài)變化的觀察倒置相差顯微鏡下觀察未經(jīng)處理和經(jīng)AEoAPC 處理24、48、72 h 后的人乳腺癌細胞MCF－7 的形態(tài)學(xué)變化，透射電子顯微鏡下觀察其細胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 人乳腺癌細胞MCF －7 的凋亡和細胞周期檢測 采用流式細胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測法［15］。取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF －7(5×105個/mL)，加入1.0 g/L AEoAPC處理24、48、72 h 后，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，重新懸浮于1 mL、4 ℃預(yù)冷的固定液(固定液組成:1.1 g/L 葡萄糖、8.0 g/L NaCl、0.4 g/L KCl、0.39 g/L Na3PO4·12 H2O、0.15 g/L KH2PO4、0.08 g/L MgSO4·7H2O、0.16 g/L CaCl2·2H2O)中固定。緩慢加入－20 ℃預(yù)冷的95% 乙醇3 mL，使乙醇終濃度為75%，冰浴30 min，4 ℃保存。加入碘化丙啶(終濃度為50 μg/mL)和無DNA 酶污染的RNA 酶(終濃度為50 μg/mL)1 mL，染色0.5～1.0 h。流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期，由大連市中心醫(yī)院中心實驗室完成。

1.3 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計方法

IR(%)=1 －(加藥組OD 值－調(diào)零組OD 值)/(陰性對照組OD 值－調(diào)零組OD 值)×100。數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理采用SPSS 11.5 軟件進行分析處理，用方差分析統(tǒng)計檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEoAPC 對人乳腺癌細胞MCF －7 增殖的影響

將不同濃度的AEoAPC 處理人乳腺癌細胞MCF－7 24、48、72 h 后，本實驗不同作用濃度下，試驗結(jié)果顯示，在0.8 g/L 濃度下對人乳腺癌細胞MCF－7 作用48 h 其抑制率更接近半數(shù)(55.4%)，因此視最佳藥物作用質(zhì)量濃度為0.8 g/L，以該濃度的AEoAPC 處理人乳腺癌細胞MCF－7 24、48、72 h后，對人乳腺癌細胞MCF －7 的生長抑制率分別為32.6%、55.4%、86.6%。MTT 比色法顯示，AEoAPC對人乳腺癌細胞MCF －7 有抑制作用，且在一定濃度范圍內(nèi)抑制率呈明顯的時間劑量依賴性(表1)。

2.2 AEoAPC 對人乳腺癌細胞MCF －7 形態(tài)的影響

在倒置熒光顯微鏡下觀察人乳腺癌細胞MCF－7，對照組的人乳腺癌細胞MCF －7 生長旺盛，形態(tài)完整，膜透明，大小均一，呈梭形貼壁生長(圖1 －A1～A3);AEoAPC 處理組的人乳腺癌M 細胞MCF－7 生長受到抑制，細胞增長減緩。其中0.8 g/L AEoAPC 處理組單位面積的人乳腺癌細胞MCF －7數(shù)量逐漸減少，細胞間連接消失，并且隨著用藥時間的延長，人乳腺癌細胞MCF－7 數(shù)量明顯減少，細胞顏色變暗，膜顏色加深，細胞形狀不規(guī)則，梭形細胞減少，變圓(圖1－B1～B3)。在透射電子顯微鏡下觀察人乳腺癌細胞MCF －7，對照組的人乳腺癌細胞MCF －7細胞膜完整，細胞核和細胞器結(jié)構(gòu)完整清晰，染色質(zhì)分布均勻(圖1 －C1);AEoAPC 處理組的人乳腺癌細胞MCF－7 的核染色質(zhì)出現(xiàn)邊集，胞質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象(圖1 －C2)。

表1 AEoAPC 對人乳腺癌細胞MCF－7 生長的抑制作用

圖1 AEoAPC 處理不同時間的人乳腺癌細胞MCF－7 形態(tài)觀察

2.3 AEoAPC 對人乳腺癌細胞MCF －7 的周期和凋亡的影響

對照組的人乳腺癌細胞MCF －7 在培養(yǎng)24、48、72 h大多數(shù)處于G0－G1期(DNA 合成前期)及S期(DNA 合成期)，G2－M 期(DNA 合成后期)最少，其凋亡率為1.27%;經(jīng)0.8 g/L AEoAPC 處理的人乳腺癌細胞MCF －7 出現(xiàn)了被認為凋亡細胞的亞G0－G1期，其凋亡率隨著AEoAPC 作用時間的延長而提高，在24、48、72 h 的凋亡率分別為8.65%、14.20%、26.30%。其AEoAPC 對人乳腺癌細胞MCF－7 周期的阻斷效應(yīng)見表2。

表2 經(jīng)AEoAPC 誘導(dǎo)的人乳腺癌細胞MCF－7 在各細胞周期的細胞核DNA 含量及凋亡率

3 小結(jié)與討論

乳腺癌是威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制及治療一直是臨床亟待解決的重要課題，雖經(jīng)多年研究，目前仍未找到有效的治療手段。由于中藥具有多途徑、多靶點、毒副作用低等優(yōu)點，從中藥中尋找抗乳腺癌藥物越來越成為廣大臨床醫(yī)師的研究熱點。AEoAPC 是從柞蠶蛹蟲草中提取的有效組分，主要含有蟲草素、腺苷等核苷類、多糖類、蟲草酸、超氧化物歧化酶和硒類化合物，具有鎮(zhèn)靜、抗疲勞、抗腫瘤的作用，可增強機體的免疫功能［16］。近年來，有研究證明蛹蟲草具有一定的抗腫瘤活性，對胃癌［17］、肝癌［18］、喉鱗癌［19］等均有一定的殺傷作用，但其抗腫瘤作用的確切機制尚不十分明確。

本研究加入濃度0.8 g/L AEoAPC 作用于人乳腺癌細胞MCF－7 后，分別于24、48、72 h 進行MTT比色實驗和流式細胞術(shù)分析，MTT 比色結(jié)果顯示，AEoAPC 對人乳腺癌細胞MCF －7 的體外增殖均有一定的抑制作用，與對照組比較，人乳腺癌細胞MCF－7 隨著作用時間的延長，生存的數(shù)量明顯減少;流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，隨著藥物作用時間的增加，G0－G1期的細胞分布明顯增多，G2期和S 期細胞有所減少。證實AEoAPC 作用于人乳腺癌細胞MCF－7 時可改變細胞的增殖周期動力學(xué)，表現(xiàn)為G0－G1期比率上升，G2－S 期比率下降，阻滯腫瘤細胞S 期和G2期，使腫瘤分裂能力下降，使乳腺癌細胞增殖受到抑制，生長出現(xiàn)停滯。試驗結(jié)果表明:AEoAPC 能顯著抑制人乳腺癌細胞MCF －7 的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，且在一定的濃度范圍內(nèi)呈時間和濃度依賴性。AEoAPC 細胞周期阻斷效應(yīng)是導(dǎo)致凋亡細胞增多的重要原因，這種阻斷作用的增強可產(chǎn)生細胞同步化效應(yīng)，為AEoAPC 在臨床上與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用以提高化療效果提供了理論依據(jù)。

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