朱文 蔣法興 蘇曉紅 樂(lè)文靜 王娜

·論著·

淋球菌rpsE基因突變與大觀霉素耐藥性的研究

朱文 蔣法興 蘇曉紅 樂(lè)文靜 王娜

目的探討淋球菌rpsE基因突變與淋球菌大觀霉素耐藥的相關(guān)性。方法對(duì)臨床分離的4株大觀霉素耐藥的淋球菌株(MIC128 μg/ml、256 μg/ml)的rpsE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序分析，尋找可能的突變位點(diǎn)，通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)將含有突變基因的細(xì)菌基因組DNA轉(zhuǎn)化入敏感的淋球菌株，檢測(cè)轉(zhuǎn)化成功的淋球菌的MIC并進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)與淋球菌大觀霉素耐藥的相關(guān)性。結(jié)果4株大觀霉素耐藥的菌株均發(fā)現(xiàn)rpsE基因A70C(Thr24Pro)突變，而16S rRNA大觀霉素耐藥決定區(qū)(SRDR)未發(fā)現(xiàn)任何突變；大觀霉素敏感菌株的16S rRNA和rpsE基因均未發(fā)現(xiàn)突變。轉(zhuǎn)化后獲得的大觀霉素耐藥淋球菌中亦發(fā)現(xiàn)了同樣的rpsE基因突變。結(jié)論rpsE基因單點(diǎn)突變與淋球菌對(duì)大觀霉素耐藥相關(guān)。

淋病奈瑟球菌；基因，rpsE；點(diǎn)突變；大觀霉素；抗藥性

淋球菌是最常見(jiàn)的性傳播感染的病原體之一。由于至今仍沒(méi)有研制出淋球菌疫苗，及時(shí)診斷和早期抗生素治療淋病患者是目前控制淋球菌傳播的有效方法。我國(guó)目前僅推薦頭抱曲松與大觀霉素用于治療淋球菌感染，頭抱曲松可能會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)并且已分離出對(duì)頭抱曲松耐藥的淋球菌株[1]，使得大觀霉素對(duì)淋病的治療更為重要。隨著大觀霉素的廣泛應(yīng)用，大觀霉素耐藥淋球菌也相繼出現(xiàn)。蘇曉紅等[2]于2003年報(bào)告了大觀霉素治療淋病失敗3例原因分析，其中有2例為大觀霉素耐藥菌株所致。研究表明，rpsE基因編碼的核糖體5S蛋白位于大觀霉素結(jié)合部位附近，該基因發(fā)生突變可能導(dǎo)致大觀霉素耐藥菌株的形成。本研究對(duì)南京地區(qū)和合肥地區(qū)分離的4株大觀霉素耐藥淋球菌(MIC≥128 μg/ml)的16S rRNA大觀霉素耐藥決定區(qū)(spectinomycin resistance-determining region，SRDR)和 rpsE 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序分析，并將含有突變基因的淋球菌基因組DNA轉(zhuǎn)入敏感的淋球菌株，探討rpsE基因單點(diǎn)突變與淋球菌對(duì)大觀霉素耐藥的相關(guān)性。

資料與方法

一、資料

1.試驗(yàn)菌株(表1):4株大觀霉素耐藥的淋球菌和2株大觀霉素敏感的淋球菌。其中2株大觀霉素耐藥的菌株(06-3，06-5)和2株大觀霉素敏感的(12-11358，11-8679)收集于2004—2012年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所性病門診中有癥狀的淋病患者，另外2株(G1，G2)收集于2007—2013年安徽省立醫(yī)院皮膚性病科門診。所有菌株均經(jīng)過(guò)革蘭染色顯微鏡鏡檢、氧化酶實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)鑒定為淋球菌。菌株于-70℃保存于20%甘油肉湯(TSB-Gly)備用。

表1 臨床分離淋球菌對(duì)抗生素的MIC μg/ml

2.培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件:①固體培養(yǎng)基:淋球菌分離培養(yǎng)基購(gòu)自珠海銀科醫(yī)學(xué)工程公司。后續(xù)的瓊脂稀釋法MIC實(shí)驗(yàn)使用的是GC巧克力培養(yǎng)基(GC瓊脂基礎(chǔ)18.5 g+血紅蛋白粉5.5 g)溶于500 ml體積雙蒸水中，20 min，121℃高壓滅菌后冷卻至50℃時(shí)加入增菌劑Vitox Supplement 10 ml，4℃保存，1周內(nèi)用完。淋球菌均在37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h；②液體培養(yǎng)基:淋球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)使用淋球菌液體培養(yǎng)基(15 g示蛋白胨，4 g K2HPO4，1 g KH2PO4，1 g NaCl)溶于 1 L 雙蒸水中，20 min，121 ℃高壓滅菌后冷卻至50℃時(shí)加入增菌補(bǔ)充液Ⅰ10 ml和補(bǔ)充液Ⅱ1 ml。補(bǔ)充液Ⅰ:葡萄糖40 g，谷氨酰胺1 g，硫胺素焦磷酸2 mg溶于100 ml體積雙蒸水中，補(bǔ)充液Ⅱ:Fe(NO3)3-9H2O，50 mg溶于100 ml雙蒸水中，兩種補(bǔ)充液均在生物安全柜通過(guò)0.2 μm濾菌器消毒滅菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、方法

1.藥物敏感性實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)藥物均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。淋球菌的藥物敏感性試驗(yàn)采用瓊脂稀釋法，以倍比稀釋法制備含不同濃度大觀霉素的瓊脂培養(yǎng)基(8～512 μg/ml)。以淋球菌ATCC49226作為藥敏質(zhì)控菌株，以美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，即:MIC≥ 128 μg/ml為耐藥，MIC 64 μg/ml為中度敏感，MIC ≤ 32 μg/ml為敏感。青霉素、頭抱曲松、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所提供。

2.細(xì)菌DNA的提取:淋球菌基因組DNA的提取采用BuccalAmpTMDNA試劑盒(美國(guó)Epicentre BioTechnologies公司)，提取的DNA于4℃保存用于PCR反應(yīng)，提取的G1菌的基因組DNA用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

3.PCR擴(kuò)增rpsE全基因片段:上游引物為5'-TGAGAAGGCTAAAGCAGCAGGTGT-3'，下游引物為 5'-CGTGCACATGCACGATGAGATTCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為包括rpsE全基因在內(nèi)的727 bp片段；擴(kuò)增16SrRNA基因的大觀霉素耐藥決定區(qū)(SRDR)相關(guān)片段:采用Galimand等[3]和基于淋球菌全基因組序列FA1090(AE004969)設(shè)計(jì)的引物，上游引物為5'-CTTACCTGGTCTTGACA-3'，下游引物為 5'-CGATTACTAGCGATTCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為16SrRNA基因上包括SRDR在內(nèi)的373 bp片段；PCR反應(yīng)總體系 50 μl，其中 Taq 酶 1.5 U，dNTP(各 2.5 mmol/L)4 μl，模板 DNA 2 μl，引物各 1 μl(0.4 μmol/L)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。以雙蒸水為模板的擴(kuò)增體系作陰性對(duì)照，大觀霉素耐藥菌株WHOA作陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下觀察結(jié)果，美國(guó)Eager eye圖像分析系統(tǒng)掃描照相。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

4.DNA轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4]，主要步驟如下:①取20 μl供體菌G1的基因組DNA加入200 μl含有5 mmol/L MgSO4的GCBL中，渦旋5 s后37℃預(yù)熱備用；②接種環(huán)刮取復(fù)蘇20 h受體菌11-8679培養(yǎng)皿，上1/2的菌落懸浮于1 ml 37℃預(yù)熱的GCBL中，渦旋備用；③渦旋后的受體菌液20 μl加入制備的DNA溶液中，37℃，15 min混合；④制備的全部轉(zhuǎn)化液加入2 ml GCBL中，培養(yǎng)管半蓋，37℃，5%CO2環(huán)境下孵育4 h；⑤孵育的菌液0.1 ml與37℃預(yù)熱的GCBL 0.9 ml進(jìn)行10倍系列稀釋(10～10-6)，分別移取上述稀釋后的菌液100 μl涂布到含大觀霉素的GC巧克力瓊脂培養(yǎng)基以及無(wú)抗生素平板上，37℃，5%CO2環(huán)境下孵育48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)各個(gè)平板菌落數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率；與此同時(shí)我們用12-11358作為受體菌，重復(fù)上述轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化子均在128 μg/ml大觀霉素平板上再次培養(yǎng)18～24 h，以確定轉(zhuǎn)化成功，于-70℃保存，并提取轉(zhuǎn)化子DNA、PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

結(jié) 果

1.瓊脂稀釋法大觀霉素MIC實(shí)驗(yàn):4株淋球菌為大觀霉素耐藥(MIC≥ 128 μg/ml)，另兩株為大觀霉素敏感菌(MIC≤ 32 μg/ml)。見(jiàn)表2。

2.PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果序列比對(duì):將測(cè)序結(jié)果與質(zhì)控敏感菌株ATCC49226的16SrRNA和rpsE基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，應(yīng)用DNAstar Lasergene.(version 7.1)軟件進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列比對(duì):發(fā)現(xiàn)4株大觀霉素MIC≥128 μg/ml的淋球菌均發(fā)生rpsE基因的單點(diǎn)突變，即70位堿基A→C，其編碼的核糖體5S蛋白的第24位氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?圖1)。而2株大觀霉素MIC≤ 32 μg/ml的敏感菌株均未發(fā)生16SrRNA與rpsE基因的突變。

3.轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)將含有rpsE突變基因A70C的淋球菌基因組DNA轉(zhuǎn)化入受體菌(11-8679，12-113658)后，其對(duì)大觀霉素的MIC值均增長(zhǎng)到＞128 μg/ml的耐藥水平，在稀釋度10-1大觀霉素128 μg/ml的平板上分別有28.7±4.2個(gè)和13±4.6個(gè)菌落出現(xiàn)。PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子16SrRNA基因的大觀霉素耐藥決定區(qū)(SRDR)相關(guān)片段，與受體菌比較未發(fā)生任何突變；而轉(zhuǎn)化子的rpsE基因發(fā)生單點(diǎn)突變，即70位堿基A→C。另外，對(duì)于兩株受體菌(11-8679，12-113658)其轉(zhuǎn)化率分別為1.1±0.4×10-6和1.5±0.5×10-6提示淋球菌對(duì)大觀霉素耐藥性在菌群中傳播的風(fēng)險(xiǎn)是比較高的。

表2 臨床分離淋球菌株的大觀霉素MIC值與菌株的突變模式(以ATCC49226為對(duì)照)

圖1 rpsE基因A70C突變及對(duì)應(yīng)rps5 Thr24Pro氨基酸置換

討 論

大觀霉素為鏈霉菌所產(chǎn)生的一種氨基環(huán)醇類抗生素，其抑菌的作用機(jī)制是與細(xì)菌30S核糖體亞基結(jié)合從而抑制蛋白質(zhì)的合成，即大觀霉素直接作用于16S rRNA，在多肽延長(zhǎng)的過(guò)程中抑制延長(zhǎng)因子G(EF-G)的催化和轉(zhuǎn)位，阻止肽酰tRNA從A位點(diǎn)向P位點(diǎn)移動(dòng)[5-6]。研究表明，大觀霉素在16SrRNA上的作用位點(diǎn)位于靠近G1064-C1192的34螺旋上[7]。細(xì)菌對(duì)大觀霉素耐藥的機(jī)制:①腺苷酰轉(zhuǎn)移酶將大觀霉素腺苷?；鴾缁?，未發(fā)現(xiàn)淋球菌對(duì)大觀霉素耐藥與腺苷酰轉(zhuǎn)化酶滅活機(jī)制相關(guān)；②rpsE基因編碼的核糖體5S蛋白中2螺旋的氨基酸置換；③16SrRNA的大觀霉素結(jié)合區(qū)即螺旋34包含1063-1066和1190-1193的交聯(lián)區(qū)域的基因突變[8-9]。在淋球菌中，16SrRNA基因的單位點(diǎn)突變C1192U已證實(shí)可導(dǎo)致高水平的大觀霉素耐藥[3，10]。Unemo等[11]的研究認(rèn)為，淋球菌rpsE基因突變對(duì)應(yīng)的核糖體5S蛋白的25位氨基酸的缺失和K26E的氨基酸置換可導(dǎo)致高水平的大觀霉素耐藥。雖然核糖體5S蛋白不在大觀霉素結(jié)合區(qū)域，但它非常接近抗生素結(jié)合位(5A)[12]，核糖體5S蛋白19～33環(huán)是RNA結(jié)合部位，也是與大觀霉素耐藥有關(guān)突變最頻繁的區(qū)域[12]，因此，核糖體5S蛋白上Thr24Pro氨基酸的置換可能會(huì)影響5S蛋白與16SrRNA 34螺旋的作用，從而參與淋球菌對(duì)大觀霉素耐藥性的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，4株大觀霉素MIC≥ 128 μg/ml的淋球菌顯示出rpsE基因的單點(diǎn)突變(A70C)，將含有rpsE突變基因A70C的淋球菌基因組DNA轉(zhuǎn)化入受體菌后，轉(zhuǎn)化子對(duì)大觀霉素MIC增長(zhǎng)到耐藥水平，并且發(fā)生了同樣的rpsE基因突變，該突變對(duì)應(yīng)的核糖體5S蛋白氨基酸置換(Thr24Pro)導(dǎo)致了淋球菌對(duì)大觀霉素耐藥性的產(chǎn)生。

目前，淋球菌已對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，且隨著抗菌藥物的長(zhǎng)期使用及不合理使用，耐藥性呈上升趨勢(shì)，給淋病的治療和預(yù)防帶來(lái)困難。2011年7月，Ohnishi等[13]報(bào)道日本新發(fā)現(xiàn)的耐藥菌株H041，該菌株對(duì)除大觀霉素以外其他所有抗菌藥物有耐藥性。美國(guó)和挪威也相繼發(fā)現(xiàn)了這種耐藥菌株。到目前為止，盡管偶爾檢出耐大觀霉素的淋球菌[14]，但對(duì)包括我國(guó)在內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家來(lái)說(shuō)，大觀霉素仍可作為治療淋病的一線藥物，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)淋球菌耐藥機(jī)制的研究以應(yīng)對(duì)不斷嚴(yán)重的耐藥形勢(shì)。

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2013-10-21)

(本文編輯:吳曉初)

Mutations in the rpsE gene and spectinomycin resistance inNeisseria gonorrhoeae

Zhu Wen*，Jiang Faxing，Su Xiaohong，Le Wenjing，Wang Na.*Department of Dermatology，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China

s：Jiang Faxing，Email：jiangfxing@126.com；Su Xiaohong，Email：suxhong@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the relationship between spectinomycin resistance inNeisseria gonorrhoeaeand mutations in the rpsE gene.MethodsGenomic DNA was extracted from 4 clinical isolates ofNeisseria gonorrhoeaewith different levels of spectinomycin resistance.Then，PCR was performed to amplify the entire rpsE gene and the spectinomycin resistance-determining region(SRDR)in the 16S rRNA gene followed by direct sequencing.Two spectinomycin-sensitiveNeisseria gonorrhoeaestrains were transformed with the genomic DNA containing the mutant rpsE gene.Subsequently，the susceptibility of the transformants to spectinomycin was determined，and PCR was performed to amplify the rpsE and 16S rRNA genes in the transformants followed by sequencing.ResultsAll the 4 spectinomycin-resistantNeisseria gonorrhoeaestrains harbored an A70C transversion in the rpsE gene，but no abnormality in the SRDR of the 16S rRNA gene.No mutations were detected in the spectinomycin-sensitiveNeisseria gonorrhoeaestrains.The A70C transversion in the rpsE gene was also detected in the twoNeisseria gonorrhoeaetransformants with spectinomycin resistance.ConclusionThe A70C point mutation within the rpsE gene is associated with spectinomycin resistance inNeisseria gonorrhoeae.

Neisseria gonorrhoeae；Genes，rpsE；Point mutation；Spectinomycin；Drug resistance

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.001

安徽省自然科學(xué)基金(0904131430)

230001合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院皮膚科(朱文、蔣法興、王娜)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所(蘇曉紅、樂(lè)文靜)

蔣法興，Email:jiangfxing@126.com；蘇曉紅，Email:suxhong@yahoo.com