嚴(yán)文文，劉文曉，黃俊柅，肖 鵬

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510631)

突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation，LTP)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)［1］. 海馬內(nèi)環(huán)路有3個(gè)興奮性單突觸通路，即穿通纖維通路(Perforant pathway，PP)與DG 顆粒細(xì)胞的樹突形成的突觸(PP-DG)，顆粒細(xì)胞發(fā)出的軸突組成的苔蘚纖維(Mossy fibers，MF)與CA3 區(qū)錐體細(xì)胞的頂樹突形成的突觸(MF-CA3)，錐體細(xì)胞的軸突從海馬傘傳出，其側(cè)支(Schaffer collaterals)反折到CA1 區(qū)(Schaffer-CA1)，與錐體細(xì)胞的頂樹突形成的突觸［2］. 此外，穿通纖維還存在不經(jīng)DG 顆粒細(xì)胞直接到達(dá)CA3 區(qū)和CA1 區(qū)的投射. 海馬離體腦片工作表明在以上通路上均可誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)直性LTP［3］.本課題組在直接結(jié)合行為學(xué)習(xí)的研究中表明，動(dòng)物經(jīng)行為學(xué)習(xí)后可在其海馬各環(huán)路出現(xiàn)習(xí)得性LTP［4］. LTP 可分為2 種類型，即NMDA 受體依賴型和非NMDA 受體依賴型［5－6］. 大多數(shù)LTP 均為NMDA 受體依賴型，有關(guān)NMDA 受體依賴型強(qiáng)直性LTP 的表達(dá)機(jī)制目前仍有爭(zhēng)論，有報(bào)導(dǎo)指出其表達(dá)過程涉及遞質(zhì)釋放量增多［1］，也有人認(rèn)為其表達(dá)過程僅與突觸后受體有關(guān)［7］. MF-CA3 突觸的LTP 為非NMDA 受體依賴型，腦片研究表明，該突觸通路的強(qiáng)直性LTP 在其誘導(dǎo)和維持過程中雙脈沖易化(Paired-pulse facilitation，PPF)效應(yīng)會(huì)下降［8］. PPF效應(yīng)是指緊接著第1個(gè)檢測(cè)刺激的第2個(gè)檢測(cè)刺激引起突觸后反應(yīng)的增強(qiáng)［9］. 任何改變突觸前遞質(zhì)釋放率的因素都會(huì)改變PPF［10］. 這種PPF 效應(yīng)的改變提示離體腦片MF-CA3 突觸強(qiáng)直性LTP 的誘導(dǎo)及表達(dá)涉及突觸前機(jī)制［11］. 然而，這種強(qiáng)直或離體腦片技術(shù)割裂了整體的整合作用，采用整體及結(jié)合行為學(xué)習(xí)的研究方法，對(duì)探討學(xué)習(xí)記憶與突觸傳遞效應(yīng)的關(guān)系問題顯得更為必要. 本文采用雙脈沖檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定在體MF-CA3 突觸習(xí)得性LTP 誘導(dǎo)前后及表達(dá)過程中PPF 效應(yīng)的變化，對(duì)探討該突觸習(xí)得性LTP 與突觸前機(jī)制的關(guān)系具有參考意義.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Sprague Dawley 系雄性成年大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK 粵2004－0011. 動(dòng)物隨機(jī)分為不同間隔雙脈沖檢測(cè)組(n =8)，訓(xùn)練組(n=8)和基線對(duì)照組(n =8). 不同間隔雙脈沖檢測(cè)組每實(shí)驗(yàn)日分別采用50、75、100、125、150 ms 間隔的雙脈沖檢測(cè)MF-CA3 突觸的群體峰電位(Population spike，PS)峰值;訓(xùn)練組每實(shí)驗(yàn)日進(jìn)行明暗辨別學(xué)習(xí)訓(xùn)練，在每實(shí)驗(yàn)日訓(xùn)練作業(yè)前及訓(xùn)練作業(yè)結(jié)束后采用間隔為150 ms 的雙脈沖檢測(cè)MF-CA3 突觸PS 峰值;基線對(duì)照組不進(jìn)行訓(xùn)練，每實(shí)驗(yàn)日只用間隔為150 ms 的雙脈沖檢測(cè)MF-CA3 突觸的PS峰值.

1.2 電極埋植

實(shí)驗(yàn)前，所有動(dòng)物均在無菌條件下進(jìn)行慢性電極埋植手術(shù).首先在腹腔注射戊巴比妥鈉將動(dòng)物麻醉(劑量為35 mg/kg).電極埋植手術(shù)過程在腦立體定位儀上進(jìn)行. 記錄電極為一枚絕緣不銹鋼針(Ф 0.2 mm，尖端阻抗0.5～3.0 ΜΩ)，尖端定位于海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞層，根據(jù)布瑞希圖譜，定位為:AP 3.1～3.5;R(L)3.2～3.4;H 3.4～4.2. 刺激電極由兩根絕緣的鎳鉻合金絲(Ф140 μm)絞合而成，尖端裸露0.2～0.3 mm，兩尖端上下相距0.5～0.6 mm，埋植于海馬DG 區(qū)的顆粒細(xì)胞層，定位為AP 3.1～3.5;R(L)1.9～2.1;H 3.5～4.1;參考電極為固定在顱骨上的小螺絲釘. 選擇一能記錄到突觸反應(yīng)的強(qiáng)度固定不變，然后逐步調(diào)節(jié)刺激電極和記錄電極直至能記錄到最大PS 反應(yīng)的部位，用牙托粉小心封固，術(shù)后待動(dòng)物康復(fù)3 天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3 行為訓(xùn)練模型

采用的學(xué)習(xí)模型為明暗辨別學(xué)習(xí)，在MD-IA 三等分輻射式迷宮(長(zhǎng)45 cm ×寬14 cm ×高16 cm)中進(jìn)行. 訓(xùn)練方法同前文［12－13］，即每實(shí)驗(yàn)日同一時(shí)間進(jìn)行20 次訓(xùn)練測(cè)試，每2 次測(cè)試間的時(shí)間間隔隨機(jī)為20～40 s，隨機(jī)給予不同燈臂電擊，電擊強(qiáng)度為0.45 mA，電擊持續(xù)時(shí)間為1 s，電擊延時(shí)5 s，以20次測(cè)試中90%的正確反應(yīng)率為達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn). 動(dòng)物行為達(dá)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)后再鞏固訓(xùn)練3 d.

1.4 數(shù)據(jù)采集與處理

檢測(cè)以PS 峰值為評(píng)價(jià)指標(biāo). 檢測(cè)刺激強(qiáng)度固定在訓(xùn)練前能引起1/3 至1/2 最大PS 效應(yīng)的刺激強(qiáng)度，波寬為0.1 ms，雙脈沖(即第一個(gè)脈沖與第二個(gè)脈沖)的間隔為從50、75、100、125、150 ms 中選取記錄到穩(wěn)定PPF 的脈沖間隔參數(shù).檢測(cè)刺激由刺激電極經(jīng)SEN-7203 生理刺激器和MEZ-7101 隔離器輸出，誘發(fā)電位由記錄電極經(jīng)SS-102J 微電極放大器，DSJ-F 生理放大器及A/D 卡三級(jí)放大輸出，原始數(shù)據(jù)由“NEPAS 型生理信號(hào)分析處理系統(tǒng)”［14］在微機(jī)上進(jìn)行采集和分析. PS 峰值增加30%以上表明出現(xiàn)習(xí)得性LTP［15］. PPF 易化率的計(jì)算為第二個(gè)脈沖反應(yīng)的PS 峰值與第一個(gè)脈沖反應(yīng)的PS 峰值之比(PSA2/PSA1，%).數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用非配對(duì)、雙尾t 檢驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用普魯士藍(lán)法對(duì)刺激電極和記錄電極定位進(jìn)行檢查，將定位不準(zhǔn)確者剔除.

2 結(jié)果與分析

2.1 在MF-CA3 突觸上檢測(cè)到PPF 效應(yīng)

當(dāng)雙脈沖間隔為50 ms 或75 ms 時(shí)(圖1)，在MF-CA3 突觸上可檢測(cè)到雙脈沖抑制效應(yīng)(Pairedpulse depression，PPD)，雙脈沖抑制率分別為43.87% ±14.74%和58.50% ±8.11%.當(dāng)雙脈沖間隔為100、125、150 ms 時(shí)，在MF-CA3 突觸上檢測(cè)到PPF 效應(yīng)，PPF 易化率分別為109.74% ±36.31%、125.08% ± 37.12% 和139.37% ± 11.86%. 由于150 ms 雙脈沖間隔檢測(cè)到的PPF 效應(yīng)最穩(wěn)定，故選取該間隔的雙脈沖檢測(cè)訓(xùn)練組及基線對(duì)照組的PS峰值.連續(xù)7 天，在每天同一時(shí)間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行雙脈沖檢測(cè)，結(jié)果表明，基線對(duì)照組在長(zhǎng)達(dá)7 天的檢測(cè)中，其MF-CA3 突觸上第一個(gè)檢測(cè)刺激引起的PS 峰值是穩(wěn)定的(圖2)，表明本研究采用的雙脈沖技術(shù)對(duì)MF-CA3 突觸PS 峰值的檢測(cè)未見累加效應(yīng). 即與以往的單脈沖檢測(cè)的方法一樣，可用第一個(gè)檢測(cè)刺激引起的PS 峰值作為評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)行為習(xí)得過程中突觸效應(yīng)的變化.

圖1 不同間隔的雙脈沖刺激檢測(cè)到的雙脈沖效應(yīng)(n=8)Figure 1 Paired-pulse efficacy induced by paired-pulse stimulation of different inter-pulse interval (n=8)

圖2 雙脈沖檢測(cè)對(duì)PS 峰值的影響(n=8)Figure 2 Effect of paired-pulse test on PS amplitude(n=8)

2.2 明暗辨別學(xué)習(xí)后MF-CA3 突觸出現(xiàn)習(xí)得性LTP

隨著行為訓(xùn)練，訓(xùn)練組動(dòng)物的正確反應(yīng)率逐日提高(圖3)，在第4 訓(xùn)練日達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，其正確反應(yīng)率為90.21% ±5.35%，經(jīng)過3 天鞏固訓(xùn)練，第7訓(xùn)練日的正確反應(yīng)率為95.00% ±3.54%. MF-CA3突觸的PS 峰值隨著行為訓(xùn)練逐日增大，在達(dá)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(第4 訓(xùn)練日)后PS 峰值為訓(xùn)練前基線水平的200.92% ±10.43%，經(jīng)過3 天的鞏固訓(xùn)練，PS 峰值也持續(xù)保持在最高水平，第7 訓(xùn)練日的PS 峰值為206.55% ±9.46%(圖2). 而基線對(duì)照組在連續(xù)7天的檢測(cè)中，PS 峰值則穩(wěn)定在基線水平(100%)左右. 這表明動(dòng)物經(jīng)過明暗辨別學(xué)習(xí)后，隨著行為的習(xí)得而產(chǎn)生了習(xí)得性LTP(圖2).

圖3 明暗辨別學(xué)習(xí)后正確反應(yīng)率的變化(n=8)Figure 3 Change of correct rate after behavioral learning(n=8)

2.3 MF-CA3 突觸習(xí)得性LTP 形成及穩(wěn)定后PPF易化率下降

結(jié)果表明，隨著行為學(xué)習(xí)的進(jìn)行，在習(xí)得性LTP形成后，PPF 由訓(xùn)練前平均的138.36% ±9.25%，降低到習(xí)得性LTP 形成后(第4 訓(xùn)練日)的114.75% ±8.42%，差異顯著(P ＜0.01);在習(xí)得性LTP 穩(wěn)定過程中PPF 持續(xù)維持在這個(gè)降低的水平.對(duì)照組的PPF 易化率在連續(xù)7 天的檢測(cè)中均穩(wěn)定在140%左右未見顯著變化(圖4 A、4B).

圖4 MF-CA3 突觸習(xí)得性LTP 形成及穩(wěn)定后PPF 的變化(n=8)Figure 4 Change of PPF after learning-dependent LTP at MFCA3 synapses(n=8)

3 討論

強(qiáng)直性LTP 的工作表明，海馬內(nèi)不僅存在經(jīng)典的NMDA 受體依賴型LTP，還存在非NMDA 受體依賴型LTP［5－6］. 有關(guān)腦片NMDA 受體依賴型LTP 的誘導(dǎo)機(jī)制目前已基本闡明，認(rèn)為高頻刺激引起突觸后膜產(chǎn)生持續(xù)的去極化，去極化一定程度導(dǎo)致常態(tài)下阻斷NMDA 受體通道的Mg2+移開，NMDA 受體與突觸前膜釋放的谷氨酸遞質(zhì)結(jié)合而被激活［16］，導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流，繼而觸發(fā)了一系列與Ca2+有關(guān)的生理生化反應(yīng)，激活第二信使系統(tǒng)，改變膜的性質(zhì)，觸發(fā)了LTP 的產(chǎn)生［17］. 在PP-DG 突觸上的習(xí)得性LTP 研究表明，NMDA 受體對(duì)習(xí)得性LTP 具有關(guān)鍵的啟動(dòng)作用，且與L 型電壓依賴性鈣通道存在相互關(guān)系或依賴性［4］.有關(guān)NMDA 受體依賴型LTP 形成后的保持或穩(wěn)定機(jī)制目前還存在著爭(zhēng)論，主要表現(xiàn)為突觸前學(xué)派和突觸后學(xué)派之間的爭(zhēng)論. 突觸前學(xué)派認(rèn)為其表達(dá)過程是谷氨酸遞質(zhì)釋放量增多的結(jié)果［1］;而突觸后學(xué)派則認(rèn)為其表達(dá)過程僅與突觸后受體有關(guān)［7］. 在體PP-DG 突觸上習(xí)得性LTP 的研究表明，DG 區(qū)習(xí)得性LTP 的表達(dá)與維持需突觸前遞質(zhì)與突觸后AMPA 受體的參與［4］. 在PP-CA1 突觸上，PPF 易化率在習(xí)得性LTP 形成后較形成前有顯著下降，提示在PP-CA1 通路上習(xí)得性LTP 的表達(dá)與突觸前機(jī)制有關(guān)［18］.

目前有關(guān)非NMDA 受體依賴型LTP 的研究比較少，該類型LTP 最早在海馬MF-CA3 突觸上發(fā)現(xiàn)［19］. 離體腦片研究表明，該突觸通路的強(qiáng)直性LTP 的誘導(dǎo)和維持與突觸前Ca2+的內(nèi)流和谷氨酸遞質(zhì)釋放的增加有關(guān)［11，20－22］，且該過程中伴隨著PPF 效應(yīng)下降［8，23］. PPF 是由于第一個(gè)檢測(cè)刺激后突觸末端有部分殘留的Ca2+，和第二次檢測(cè)刺激引起的內(nèi)流的Ca2+加合在一起，增強(qiáng)遞質(zhì)的釋放，因而表現(xiàn)出第二次檢測(cè)反應(yīng)大的結(jié)果. 如果第一個(gè)脈沖所引起的遞質(zhì)釋放率高，那么殘留的Ca2+少，這樣第二個(gè)脈沖所引起的遞質(zhì)釋放就少了，即PPF 易化率小;相反，如果第一個(gè)脈沖刺激所引起的遞質(zhì)釋放率低，那么殘留的Ca2+增加，這樣第二個(gè)脈沖刺激就會(huì)引起更多的遞質(zhì)釋放，PPF 易化率就大［9］.因而，任何改變遞質(zhì)釋放率的因素都會(huì)改變PPF 易化率［10］. 由此可見，如果LTP 的表達(dá)與突觸前遞質(zhì)釋放無關(guān)，那么由突觸前遞質(zhì)釋放增多所引起的PPF 效應(yīng)理應(yīng)不受影響;相反，如果LTP 形成及表達(dá)涉及突觸前遞質(zhì)釋放的增加，那么由于遞質(zhì)的釋放量在一定時(shí)間內(nèi)是有限的，因而勢(shì)必會(huì)影響PPF 效應(yīng)［24］. 該分析已在實(shí)驗(yàn)工作中得到證明［7］. 因此，通過觀察LTP 形成過程中PPF 的變化即可為研究該突觸效應(yīng)與突觸前機(jī)制的關(guān)系提供參考. 本文采用雙脈沖檢測(cè)技術(shù)和慢性電極埋植技術(shù)，結(jié)合動(dòng)物行為訓(xùn)練的方法，觀察動(dòng)物行為習(xí)得過程中在MFCA3 突觸上習(xí)得性LTP 形成及表達(dá)過程中PPF 效應(yīng)的變化. 當(dāng)雙脈沖間隔為50 或75 ms 時(shí)，MF-CA3突觸出現(xiàn)雙脈沖抑制效應(yīng);間隔為100 或125 ms時(shí)，雙脈沖易化效應(yīng)不穩(wěn)定;而當(dāng)雙脈沖間隔為150 ms 時(shí)，可出現(xiàn)穩(wěn)定的雙脈沖易化效應(yīng)，故選擇150 ms 的雙脈沖間隔檢測(cè)MF-CA3 突觸上習(xí)得性LTP形成及表達(dá)過程中PPF 效應(yīng)的變化. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著行為訓(xùn)練的進(jìn)行，訓(xùn)練組動(dòng)物明暗辨別學(xué)習(xí)的正確反應(yīng)率逐日提高，并在第4 訓(xùn)練日達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn);MF-CA3 突觸的PS 峰值逐日增大，在達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)日達(dá)到最高水平，并隨著行為習(xí)得的鞏固保持在最高水平，提示行為習(xí)得后MF-CA3 突觸形成習(xí)得性LTP. PPF 易化率在習(xí)得性LTP 形成過程中逐漸下降，在習(xí)得性LTP 形成后(第4 訓(xùn)練日)顯著下降至最低水平，并在習(xí)得性LTP 的維持過程中保持在該水平，提示MF-CA3 突觸習(xí)得性LTP 的形成及表達(dá)可能與突觸前遞質(zhì)釋放的改變有關(guān)，這對(duì)探討該突觸習(xí)得性LTP 的形成及表達(dá)與突觸前機(jī)制的關(guān)系具有一定的參考意義. 然而，鑒于整體自然狀態(tài)下的情況更為復(fù)雜，MF-CA3 突觸習(xí)得性LTP的形成及表達(dá)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究與探討.

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