烏雞低聚肽鐵配合物的穩(wěn)定性研究*

劉文穎，谷瑞增，林峰，魯軍，蔡木易

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

鐵是人體必需的微量元素之一，缺鐵性貧血是我國(guó)常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)素缺乏病，主要通過(guò)服用補(bǔ)鐵劑來(lái)防治，但常見(jiàn)的無(wú)機(jī)補(bǔ)鐵劑吸收利用率很低，并且存在不同程度的胃腸道刺激和金屬鐵銹味等缺點(diǎn)。多肽鐵配合物是一種新型的生物態(tài)鐵，可直接被腸黏膜細(xì)胞吸收，吸收率遠(yuǎn)較無(wú)機(jī)鐵高，并且天然安全，無(wú)消化道刺激，是理想的補(bǔ)鐵劑。因此，通過(guò)酶解等手段從食物蛋白中獲得生物活性短肽與鐵配合，開(kāi)發(fā)新型補(bǔ)鐵產(chǎn)品，更符合現(xiàn)代消費(fèi)者的需求［1，2］。

目前關(guān)于肽鐵配合物的研究有一些報(bào)道，如豬血蛋白肽鐵配合物、大豆肽鐵配合物、米蛋白肽鐵配合物等［3-5］，但有關(guān)烏雞低聚肽鐵配合物的研究鮮有報(bào)道。烏雞又名烏骨雞(Gallus gallus domesticus Brisson)，是傳統(tǒng)的補(bǔ)氣養(yǎng)血食材。烏雞低聚肽是以烏雞蛋白為原料，經(jīng)過(guò)酶解后獲得的小分子肽物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，烏雞低聚肽具有多種生理活性，并且具有吸收快、耗能低、易于被人體消化和吸收等特點(diǎn)［6-7］。以此為基礎(chǔ)，利用烏雞低聚肽制備肽鐵配合物，能夠多方面強(qiáng)化烏雞補(bǔ)鐵的功效。

但烏雞低聚肽鐵配合物作為食品原料，加工條件是否影響其穩(wěn)定性目前尚不明確。因此，本文以烏雞為原料制備烏雞低聚肽鐵配合物，以分子量分布和鐵含量為指標(biāo)，研究溫度、pH值和蛋白酶消化對(duì)烏雞低聚肽鐵配合物穩(wěn)定性的影響，以期為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

烏雞，市售;抗壞血酸、氯化亞鐵、無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵銨、抗壞血酸、鄰菲羅啉，北京化學(xué)試劑公司，分析純;Alcalase 2.4L、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，諾維信生物技術(shù)有限公司;三氟乙酸，英國(guó)Alfa Aesar公司，分析純;乙腈，美國(guó)Fisher公司，色譜純。

1.1.2 儀器

FE20K型pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司;YG30噴霧干燥機(jī)，無(wú)錫市陽(yáng)光干燥設(shè)備廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，普瑞斯機(jī)械有限公司;SHZ-3循環(huán)水多用真空泵，鄭州朋來(lái)儀器有限公司;LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烏雞低聚肽鐵配合物的制備

將烏雞除去內(nèi)臟，用水洗凈后切塊，用絞肉機(jī)絞碎，加適量水用勻漿機(jī)勻漿。轉(zhuǎn)移到酶解罐中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為8.5，升溫恒定至60℃后，以每克蛋白質(zhì)3000單位的酶量加入Alcalase 2.4 L，酶解2 h。之后調(diào)節(jié)pH值為7.0，溫度保持60℃，以每克蛋白質(zhì)2500單位的酶量加入木瓜蛋白酶，酶解2 h。酶解結(jié)束后，升溫至100℃，保持10 min，滅酶。冷卻后6 000×g離心15 min，取上清液。用截留分子量為2×106u的陶瓷膜過(guò)濾，以虹吸方法吸出中間清液，棄去上層油脂。然后用截留分子量為1 000 u的超濾膜超濾，得到分子量小于1 000 u的濾過(guò)液，將濾過(guò)液噴霧干燥，得到烏雞低聚肽干粉。

稱取8 g烏雞低聚肽干粉，溶解于200 mL蒸餾水中。加入2.0 g抗壞血酸防止Fe2+被氧化。調(diào)節(jié)pH值為5。加入2.0 g FeCl2·4H2O，于50℃下水浴反應(yīng)60 min，冷卻至室溫。加入4倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置1 h。抽濾收集沉淀，干燥后制得海洋膠原低聚肽鐵配合物樣品，置于干燥器中保存。

1.2.2 肽鐵配合物的分子量分布測(cè)定

用孔徑0.2 μm聚四氟乙烯過(guò)濾膜將樣品過(guò)濾，利用高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過(guò)濾。流動(dòng)相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1;進(jìn)樣體積:10 μL;流速:0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;柱溫:30℃，利用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，使用GPC軟件處理數(shù)據(jù)。5種肽標(biāo)準(zhǔn)品為:乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(分子量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量451)、桿菌酶(分子量1 450)、抑肽酶(分子量6 500)、細(xì)胞色素C(分子量12 500)，分別配制成0.1%(M/V)溶液，過(guò)膜后進(jìn)樣，制作相對(duì)分子量校正曲線［8］。

1.2.3 肽鐵配合物指標(biāo)的測(cè)定

肽鐵配合物經(jīng)過(guò)不同溫度、pH值和消化方式處理后，分別取5 mL轉(zhuǎn)移至透析袋(分子質(zhì)量8 000～14 000 u)中透析48 h后，測(cè)定鐵離子含量。將硫酸亞鐵銨配制成10 μg/mL鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，加入10%抗壞血酸溶液2.0 mL，鄰菲羅啉溶液3.0 mL，用蒸餾水定容至50 mL。37℃下反應(yīng)60 min后，測(cè)定510 nm處的吸光度。以鐵的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后稱取0.05 g烏雞低聚肽鐵，加入1 mL HCl溶解，配制成0.1%烏雞低聚肽鐵溶液。稱取1 mL溶液于50 mL容量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定其吸光度。計(jì)算公式為:

鐵含量/% =［C×10-3/(m×V1/V0)］×100

式中:C，標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品試液相應(yīng)的鐵含量，μg;m，樣品的質(zhì)量，g;V1，測(cè)定時(shí)所取樣品試液的體積，mL;V0，樣品處理后的定容體積，mL。

螯合率/%=(m1/m0)×100

式中:m1為肽鐵配合物中鐵含量，mg;m0為加入反應(yīng)體系中鐵的總量，mg。

得率/%=(W1/W0)×100

式中，W1為肽鐵配合物的總量，mg;W0為烏雞低聚肽與鐵鹽的總質(zhì)量，mg［9］。

1.2.4 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將樣品用蒸餾水配置成濃度為2 mg/mL的溶液，分裝至50 mL離心管中，置于水浴鍋中，分別在20、40、60、80 ℃下水浴，2 h 后冷卻至室溫，分別檢測(cè)其分子量分布和鐵含量。

1.2.5 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將樣品配置成濃度為2 mg/mL的溶液，分裝至50 mL離心管中，分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)各管pH為3、5、7、9，在37℃的水浴鍋中放置2 h，冷卻至室溫后分別檢測(cè)其分子量分布和鐵含量。

1.2.6 體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 胃蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)

將樣品配置成濃度為2 mg/mL的溶液，將40 mL溶液置于50 mL離心管中，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為2，在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻，加入3%(E/S)胃蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50 mL離心管，沸水中滅酶活10 min，以此作為樣品消化前對(duì)照。取出后，將剩余20 mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3 h，沸水中滅酶活10 min，冷卻至室溫后分別檢測(cè)消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。

1.2.6.2 胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)

將樣品配置成濃度為2 mg/mL的溶液，將40 mL溶液置于50 mL離心管中，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.8，在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻，加入3%(E/S)胰蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20 mL于另外1支50 mL離心管，沸水中滅酶活10 min，以此作為樣品消化前對(duì)照。取出后，將剩余20 mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3 h，沸水中滅酶活10 min，冷卻至室溫后分別檢測(cè)消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。

1.2.6.3 胃蛋白酶消化后再胰蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)

按照1.2.6.1 的方法進(jìn)行胃蛋白酶消化后，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.8，在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻，加入3%(E/S)胰蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20 mL于另外1支50 mL離心管，沸水中滅酶活10 min，以此作為樣品消化前對(duì)照。取出后，將剩余20 mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3 h于沸水中滅酶活10 min，冷卻至室溫后分別檢測(cè)消化前后的樣品的分子量分布和鐵含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，若P＜0.05，兩者有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 烏雞低聚肽鐵配合物的螯合率和得率

烏雞低聚肽鐵配合物的螯合率為83.92% ±0.13%，得率為41.49% ±0.14%。與方法相同的同類工藝相比［10］，螯合率與得率相對(duì)較高。本研究中心前期研究結(jié)果表明，烏雞低聚肽鐵配合物中的Fe2+與低聚肽中 NH2+以及-COO-形成了配位鍵，與烏雞低聚肽相比，物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。因此，烏雞低聚肽鐵配合物是一種新型的肽鐵配合物。

2.2 烏雞低聚肽鐵配合物的熱穩(wěn)定性

烏雞低聚肽鐵配合物分別在20、40、60、80℃水浴2 h之后，其分子量分布如表1所示。烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過(guò)不同的溫度處理后，分子量分布基本沒(méi)有變化，各個(gè)分子量區(qū)間的比例變化不超過(guò)2%，分子量小于1 000 u的總含量均在85%左右。不同溫度處理后，烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量如圖1所示。與對(duì)照相比，烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過(guò)不同溫度處理后，鐵含量無(wú)變化，烏雞低聚肽鐵配合物具有較好的熱穩(wěn)定性。這可能由于烏雞低聚肽僅具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一級(jí)結(jié)構(gòu)，相對(duì)比較穩(wěn)定，因此對(duì)溫度作用的耐受能力強(qiáng)一些。包小蘭［11］對(duì)大豆肽鈣復(fù)合物的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明大豆肽鈣復(fù)合物對(duì)高溫加熱具有較好的穩(wěn)定性，與本文結(jié)果一致。

表1 不同溫度下烏雞低聚肽鐵配合物的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of BSFP-Fe treated by different temperatures

2.3 烏雞低聚肽鐵配合物的酸堿穩(wěn)定性

圖1 不同溫度下烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量(*P ＜0.05)Fig.1 Iron content of BSFP-Fe treated by different temperatures(*P ＜0.05)

烏雞低聚肽鐵配合物在pH值分別為3、5、7、9的條件下水浴2 h之后，其分子量分布如表2所示。烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過(guò)不同的pH值處理后，分子量分布有一定的變化，但變化不大。由表2可以看出，烏雞低聚肽鐵配合物在性條件和堿性條件下，分子量小于1 000u的總含量略有升高，但升高不超過(guò)6%?？赡苡捎陔呐c鐵形成的大分子環(huán)狀結(jié)構(gòu)在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的作用下斷裂，形成小分子的結(jié)構(gòu)。烏雞低聚肽鐵配合物在pH 7的條件下，分子量小于1 000 u的總含量升高最少，總含量為86.18%。

表2 不同pH值下烏雞低聚肽鐵配合物的分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of BSFP-Fe treated by different pH values

烏雞低聚肽鐵配合物在不同pH值條件下的鐵含量如圖2所示。與對(duì)照相比，不同pH值處理下的烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量均顯著性降低(P＜0.05)。從圖2可以看出，在中性條件下，鐵含量降低較少，而在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，鐵含量降低較多，但在pH為3～9的范圍內(nèi)，烏雞低聚肽鐵配合物仍然有58.4%以上的鐵含量，這表明烏雞低聚肽鐵配合物中肽與鐵的結(jié)合具有一定的穩(wěn)定性。

2.4 烏雞低聚肽鐵配合物的體外消化穩(wěn)定性

圖2 不同pH值下烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量(*P ＜0.05)Fig.2 Iron content of BSFP-Fe treated by different pH values(*P ＜0.05)

烏雞低聚肽鐵配合物分別經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，其分子量分布如表3所示。烏雞低聚肽鐵配合物經(jīng)過(guò)不同的消化模式處理后，分子質(zhì)量分布有一定的變化，但變化不大。經(jīng)過(guò)蛋白酶消化后，烏雞低聚肽鐵配合物的組分中分子量小于1 000 u的總含量略有升高，但升高不到8%，分子量小于1 000 u的總含量在85% ～93%。與未消化對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)消化后，大于1 000 u和500～1 000 u的組分所占比例略有降低，140～500 u和小于140 u的組分所占比例略有升高。這表明分子量相對(duì)較大的肽段經(jīng)過(guò)蛋白酶消化后分解成小分子量的肽段或氨基酸。包小蘭［11］研究了大豆肽鈣復(fù)合物的消化穩(wěn)定性，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用后，大豆肽鈣復(fù)合物中大分子量組分含量減少，小分子量組分含量增加，但變化不明顯，因此大豆肽鈣復(fù)合物對(duì)消化酶的降解具有一定的耐受性。

表3 不同消化方式下烏雞低聚肽鐵配合物的分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of BSFP-Fe treated by different digestion modes

經(jīng)過(guò)不同消化方式處理后，烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量如圖3所示。與對(duì)照相比，烏雞低聚肽鐵配合物在胃蛋白酶、胰蛋白酶分別消化作用3 h后，鐵含量分別為57.1%、50.2%，先經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化再經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化后，烏雞低聚肽鐵配合物仍然有37.6%的鐵含量。這說(shuō)明烏雞低聚肽鐵配合物具有一定的耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。聶瑞艷等［12］考察了羅非魚(yú)魚(yú)鱗肽鈣復(fù)合物的消化穩(wěn)定性，結(jié)果表明肽鈣復(fù)合物經(jīng)過(guò)胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，鈣結(jié)合量降低了32%，證明其具有一定的抗消化性。

圖3 不同消化方式下烏雞低聚肽鐵配合物的鐵含量(*P ＜0.05)Fig.3 Iron content of BSFP-Fe treated by different digestion modes(*P ＜0.05)

從消化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，烏雞低聚肽鐵配合物的組分中分子量小于1 000u的總含量增加不到8%，但其鐵含量降低了62.4%，分子量較小的變化導(dǎo)致鐵含量較大的變化。烏雞低聚肽鐵配合物的酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也表明了這一點(diǎn)，分子量小于1 000 u的總含量增加不到6%，但鐵含量降低了41.6%。因此，烏雞低聚肽的結(jié)構(gòu)可能是影響烏雞低聚肽鐵配合物中鐵含量的重要因素。

3 結(jié)論

本研究以烏雞為原料制備出烏雞低聚肽鐵配合物，并對(duì)烏雞低聚肽鐵配合物的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，烏雞低聚肽鐵配合物具有良好的熱穩(wěn)定性，各個(gè)分子質(zhì)量區(qū)間的比例變化不超過(guò)2%，配合物的鐵含量無(wú)顯著性差異;在酸性和堿性條件下，分子質(zhì)量小于1 000 u的總含量略有升高，但升高不到6%，鐵含量有所降低，但仍然有58.4%以上的鐵含量;經(jīng)過(guò)蛋白酶消化后，分子量小于1 000 u的總含量略有升高，但升高不到8%，經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化和胰蛋白酶共同消化后，仍然有37.6%的鐵含量。烏雞低聚肽鐵配合物的這些特性有利于在食品加工中的應(yīng)用，并且被人體攝入后，能在體內(nèi)發(fā)揮原有的生理活性。烏雞低聚肽鐵配合物可作為一種新型的生物態(tài)鐵，開(kāi)發(fā)成適用于病人和特殊人群的營(yíng)養(yǎng)與功能食品。

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