仲崇亮 周建偉 劉 浩 王 力 龍瑞軍*

(1.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，蘭州 730000;2.蘭州大學青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心，蘭州 730000)

尿素氮是反芻動物氮素循環(huán)的重要載體，對維系機體氮平衡具有重要意義;氨態(tài)氮是合成瘤胃微生物蛋白質(zhì)的原料，對供給宿主動物氨基酸營養(yǎng)起到關鍵性作用。迄今為止，人們已經(jīng)對反芻動物氮代謝進行了大量研究，并積累了許多有關反芻動物氨的產(chǎn)生、吸收、利用和尿素循環(huán)的資料。牦牛(Bos grunniens)作為能夠在高寒缺氧環(huán)境中生存的大型反芻家畜，其氮代謝的相關研究相對滯后。近年來，許多學者推測，在青藏高原牧草生長期短、生物量季節(jié)變化大的嚴酷自然環(huán)境下，牦牛對長期的氮源缺乏可能形成了一種特殊的適應機制［1－3］。另外，過度放牧和氣候變暖導致草場退化，進一步加劇了牦牛氮源供給的不足，使得牦牛的生產(chǎn)性能呈下降趨勢［4－5］。由此可見，對牦牛開展氮代謝的相關研究顯得尤為重要。據(jù)報道，牦牛比本地黃牛和其他低海拔反芻家畜能更有效地利用飼糧中的氮［6－9］;特別是在氮營養(yǎng)脅迫條件下，牦牛肝臟合成的尿素是飼糧可消化氮的2倍之多，并且其中87%可重新進入消化道，為瘤胃微生物提供氮源［10］。這些進一步說明，長期的環(huán)境和營養(yǎng)脅迫，牦?？赡苄纬闪烁咝У娘暭Z氮消化吸收能力和強大的體內(nèi)氮素循環(huán)利用能力，以調(diào)節(jié)體內(nèi)氮平衡和應對季節(jié)性營養(yǎng)匱乏。反芻動物體內(nèi)不同部位的尿素氮和氨態(tài)氮是觀測氮代謝的最直觀指標，而近些年來，關于飼糧氮水平對牦牛體內(nèi)不同部位氨態(tài)氮和尿素氮濃度變化特征的研究鮮有報道。本試驗主要研究在氮水平不同，能量水平一致的飼糧條件下，牦牛瘤胃液氨態(tài)氮(RNN)、瘤胃液尿素氮(RUN)、血漿尿素氮(PUN)、唾液尿素氮(SUN)濃度以及尿中尿素氮(UUN)、尿中氨態(tài)氮(UNN)日排泄量的變化，并進行相關性和回歸分析，為進一步研究牦牛氮代謝動力學過程和機制提供理論依據(jù)，并為牦牛的科學飼養(yǎng)和管理提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和日期

飼養(yǎng)試驗和樣品采集，于2013年11月至2014年1月在甘肅省天祝藏族自治縣烏鞘嶺(北緯 37°12.479'，東經(jīng) 102°51.695'，海拔 3 154 m)實驗站完成;樣品實驗室分析，于2014年3月至2014年4月在蘭州大學青藏高原生態(tài)系統(tǒng)管理國際中心進行。

1.2 試驗動物和飼糧

選取4頭體重［(192±12)kg］相近的3歲去勢健康公牦牛為試驗動物。試驗開始前，對牦牛作驅(qū)蟲處理，并置于代謝籠內(nèi)進行30 d的適應期，使其熟悉飼養(yǎng)條件、飼養(yǎng)人員和周圍環(huán)境。飼糧的粗料為青稞秸稈，精料為代謝能和中性洗滌纖維含量基本一致而氮水平不同的4種顆粒料，精粗比為50∶50，由此構(gòu)成4種氮水平的試驗飼糧［以粗蛋白質(zhì)水平(干物質(zhì)基礎)計，分別為6.45%、12.18%、17.81%、23.49%］，其組成及營養(yǎng)水平見表1。通過預試驗確定牦牛的干物質(zhì)采食量為 3 kg/d，約為體重的 1.5%，采食能量為 1.2倍維持需要。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 試驗設計與飼養(yǎng)管理

本試驗采用4×4拉丁方設計，分4個試驗期，每期21 d(包括15 d的預試期和6 d的正試期)。試驗牦牛于每天08:00和18:00各飼喂1次，每次干物質(zhì)飼喂量為1.5 kg(3 kg/d)。自由飲水。試驗牦牛于每個正試期的第1和2天(平均值為初重)以及第5和6天(平均值為末重)空腹稱重。

1.4 樣品采集與分析

正試期采用全收糞尿法，連續(xù)5 d收集并記錄每頭牛每天的糞尿排泄量。將每天收集的尿樣混勻，按總尿量的2%取樣，并用50%的硫酸溶液酸化，使pH＜3.0(利于固定氨態(tài)氮和抑制微生物生長)，置于－20℃下保存，用于測定UUN和UNN日排泄量。將每天收集的糞樣混勻，利用四分法按總糞量的5%取樣;然后，將每期試驗收集的5 d糞樣混勻，置于－20℃保存，用于測定糞氮。

在每個正試期第6天，晨飼前(0 h)和晨飼后2、4、6、8 h(即 08:00、10:00、12:00、14:00 和16:00)采集唾液、血液和瘤胃液。采集唾液10 mL，800×g離心15 min，取上清液分裝到 5 mL離心管，－20℃下保存，用于測定SUN濃度。血液采集采用注射器頸靜脈抽血法，每頭牛抽取10 mL血液樣品，注入15 mL離心管并加入適量乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，800×g離心15 min后，取上清液(血漿)置于若干1.5 mL離心管中，－20℃下保存，用于測定PUN濃度。用瘤胃管抽取100 mL瘤胃液后，4層紗布過濾，分裝到5 mL離心管中，并加入1～2滴飽和HgCl2溶液滅活，800×g離心15 min，取上清液置于若干1.5 mL離心管中，－20℃下保存，用于測定RUN和RNN濃度。

飼糧粗蛋白質(zhì)、有機物、粗灰分、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照《飼料分析與檢測》［12］中的方法測定;糞中氮含量，采用凱氏定氮法測定［13］;UUN 日排泄量和 SUN、PUN、RUN 濃度采用二乙酰一肟法［14］測定;UNN日排泄量和RNN濃度采用Broderick等［15］的比色法測定。氮進食量根據(jù)干物質(zhì)采食量和飼糧粗蛋白質(zhì)含量計算得出;可消化氮進食量為氮進食量和糞中氮排出量之差。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行初步統(tǒng)計處理，并采用SPSS 21.0中的 Mixed Model模塊進行差異顯著性分析和多重比較;采用雙變量相關分析(Pearson)模塊進行各變量間的相關性分析，并應用回歸分析中的一元線性、多元線性和曲線回歸模塊分析和建立數(shù)學模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的變化特征

由表2和表3可知，飼糧氮水平對UUN、UNN日排泄量以及RNN、PUN、SUN濃度均有極顯著影響(P＜0.01)，且都隨著飼糧氮水平的升高而增加;對RUN濃度無顯著影響(P＞0.05)，但有隨著飼糧氮水平升高而增加的趨勢(P＜0.10)。

2.2 晨飼后不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的動態(tài)變化

由表3可知，1)晨飼后時間對RNN濃度有極顯著影響(P＜0.01);晨飼后，各組RNN濃度迅速升高，在2 h到達最高，后緩慢降低。2)晨飼后時間對SUN濃度有顯著影響(P＜0.05);采食后，各組SUN同樣呈現(xiàn)先升高后降低，但濃度高峰出現(xiàn)在4 h，且飼糧氮水平越低，變化曲線越平緩。3)晨飼后時間對PUN和RUN無顯著影響(P＞0.05)。

表2 不同飼糧氮水平下牦牛尿中尿素氮和尿中氨態(tài)氮日排泄量Table 2 Daily excretions of UUN and UNN in yaks under different dietary N levels g/d

表3 不同飼糧氮水平和晨飼后時間對牦牛瘤胃液氨態(tài)氮、血漿尿素氮、唾液尿素氮及瘤胃液尿素氮濃度的影響Table 3 Effects of different dietary N levels and time after morning feeding on concentrations of RNN，PUN，SUN and RUN in yaks mg/dL

2.3 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間相關性及相關數(shù)學模型的建立

2.3.1 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間的相關性

由表4可知，RUN濃度與RNN、PUN、SUN濃度以及UNN日排泄量之間相關性均不顯著(P＞0.05);而其他各氨態(tài)氮和尿素氮指標間均存在顯著或極顯著的正相關性，如RNN濃度與SUN濃度(r=0.971，P＜0.01)，SUN 濃度與 UUN 日排泄量(r=0.943，P＜0.01)，UUN 日排泄量與 UNN 日排泄量(r=0.902，P＜0.01)均有極顯著正相關性。

2.3.2 相關數(shù)學模型的建立

通過回歸分析 RNN、RUN、PUN、SUN濃度(mg/dL)，UUN、UNN 日排泄量(g/d)，粗蛋白質(zhì)進食量(CPI，g/d)以及可消化粗蛋白質(zhì)進食量(DCPI，g/d)等指標，可建立以下數(shù)學模型。

2.3.2.1 估測牦牛RNN和PUN濃度的模型

2.3.2.2 估測牦牛CPI的一元和多元變量模型

2.3.2.3 估測牦牛DCPI的一元和多元變量模型

表4 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間的相關性Table 4 Correlations between indexes of NH3-N and urea-N at different parts in yaks

3 討 論

3.1 不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的變化特征

一般認為，反芻家畜瘤胃微生物生長的RNN濃度耐受范圍為 6～30 mg/dL［16］，而本試驗飼喂粗蛋白質(zhì)水平為 6.45%、12.18%和 17.81%的飼糧的結(jié)果(分別為 1.02、3.06 和 5.66 mg/dL)都低于這個范圍。據(jù)韓興泰等［17］報道，飼喂粗蛋白質(zhì)水平為 8.01%和 11.76%的飼糧(代謝能分別為 9.62和9.66 MJ/kg，干物質(zhì)基礎)時，生長期牦牛 RNN濃度分別為3.3和5.9 mg/dL，也低于上述耐受范圍。相似飼糧條件下，本試驗結(jié)果低于其他反芻動物(表 5［18－25］)。另外，據(jù)韓興泰等［26］的報道，與其他反芻動物相比，牦牛瘤胃細菌具有較低的粗蛋白質(zhì)水平，使得MCP的合成效率僅為69 g/kg(每千克可消化有機物合成粗蛋白質(zhì)的量)，低于其他反芻動物的平均值169 g/kg，但對干物質(zhì)和有機物的復胃消化率并無顯著影響［17］。綜上，牦牛具有較低的RNN濃度和較低的MCP合成效率，但對干物質(zhì)和有機物的復胃消化率并沒有顯著影響，這可能與牦牛對營養(yǎng)脅迫的適應性有關。

反芻動物RUN主要來自飼糧和內(nèi)源尿素氮［29］。本試驗飼糧中沒有添加尿素，瘤胃中的尿素氮主要來自SUN和由血液經(jīng)瘤胃壁進入瘤胃的尿素氮。在本試驗中，雖然SUN和PUN濃度都隨著飼糧氮水平的提高而極顯著增加，但飼糧氮水平對RUN并沒有顯著影響，而且相對較低(表2)。這可能是因為，瘤胃中的脲酶降解尿素的能力是微生物利用氨氮能力的5倍［30］，高活性的脲酶使瘤胃液中的尿素能夠迅速降解為氨和CO2，從而使其濃度在一定程度內(nèi)不受飼糧氮水平和采食后時間的影響，而且可以保持相對較低的水平。

3.2 晨飼后不同飼糧氮水平下牦牛體內(nèi)氨態(tài)氮和尿素氮濃度的動態(tài)變化

本試驗中，各組牦牛在采食后，1)RNN濃度，先升高然后逐漸降低，濃度的高峰出現(xiàn)在采食后2 h，這與Kim等［31］的研究結(jié)果一致。其機理可能是，牦牛采食后，瘤胃微生物使進入瘤胃的含氮物質(zhì)和碳水化合物不斷降解［32］，但在短時間內(nèi)可降解氮相對于能量處于過剩狀態(tài)，釋放出的氨沒有被及時吸收，使采食后2 h氨態(tài)氮濃度迅速升高;隨氨態(tài)氮被瘤胃微生物利用和瘤胃壁吸收，氨態(tài)氮濃度逐漸下降。2)SUN濃度同樣呈現(xiàn)先升高后降低，但濃度高峰出現(xiàn)在采食后4 h，比RNN濃度的高峰晚2 h。這可能是由營養(yǎng)物質(zhì)在機體內(nèi)吸收利用的空間效應和時間效應引起的。3)在本試驗所設的各飼糧氮水平梯度下，PUN濃度隨著采食后時間的推移，基本保持平穩(wěn)，這可能與血液系統(tǒng)自身的穩(wěn)恒機制有關。

表5 不同反芻動物的瘤胃液氨態(tài)氮濃度Table 5 RNN concentration of different ruminants

牦牛和其他反芻動物相比(表6)，1)在低氮和中低氮水平下，牦牛的PUN濃度要高于荷斯坦小母牛和肉牛;2)各氮水平下，牦牛SUN濃度高于荷斯坦小母牛;3)在4個氮水平下(由低至高)，牦牛 SUN/PUN 為 98.14%、87.54%、94.13% 和99.31%，也高于荷斯坦小母牛。在較低的飼糧氮水平下，較高的PUN和SUN濃度反映了在長期的氮脅迫條件下牦?？赡苄纬闪烁咝У膬?nèi)源氮素循環(huán)利用能力，以維持機體的氮平衡。

3.3 牦牛不同部位氨態(tài)氮和尿素氮指標間相關性及相關數(shù)學模型的建立

一般認為，尿素在機體各部分的體液中是順濃度轉(zhuǎn)運的，最終達到一種動態(tài)平衡的狀態(tài)［33］，因此機體各部分的尿素濃度以及氨態(tài)氮濃度應該具有明顯的正相關關系。本試驗測得的RNN、PUN、SUN濃度以及UUN、UNN日排泄量間兩兩極顯著正相關也證實了這個理論。理論上講，RUN濃度與這5個指標應該也有顯著正相關性，但由于瘤胃微生物所產(chǎn)生的脲酶具有極強的活性，使得RUN濃度一直維持在較低的水平。通過一元、多元線性和曲線回歸分析各個指標，發(fā)現(xiàn)估測牦牛RNN和PUN濃度的最佳指標為SUN濃度，由其建立的線性模型(模型①)和曲線模型(模型②)擬合優(yōu)度(R2)最接近1.000。RNN和PUN濃度是反映反芻動物氮代謝最重要的2個指標，而其測定往往較困難，在生產(chǎn)實踐中可以通過測定SUN濃度，估測RNN和PUN濃度。

在放牧生產(chǎn)中，測定牦牛采食量往往費時費工，而且受許多因素的影響，使得測定放牧牦牛蛋白質(zhì)實際進食量水平有一定難度［34］。因此，有必要建立數(shù)學模型去簡捷地反映牦牛蛋白質(zhì)進食水平。在本試驗測得的各指標中，估測CPI的最佳指標是RNN和RUN濃度，而估測DCPI的最佳指標是PUN濃度和UUN日排泄量。在生產(chǎn)實踐中，可以通過測定牦牛RNN、RUN和PUN濃度以及UUN日排泄量，估測牦牛的CPI以及DCPI，從而為牦牛的放牧和管理提供參考。由于本試驗數(shù)據(jù)有限(n=16)，且是牦牛舍飼條件下得到的數(shù)據(jù)，因此數(shù)學模型有待進一步驗證和優(yōu)化。

表6 不同反芻動物的血漿尿素氮和唾液尿素氮濃度Table 6 Concentrations of PUN and SUN in different ruminants

4 結(jié)論

①RNN、PUN、SUN 濃度以及 UUN、UNN日排泄量均隨著飼糧氮水平的升高而極顯著增加;且這5個指標間兩兩極顯著正相關。

② 在本試驗測得的指標中，估測RNN和PUN濃度的最佳指標是SUN濃度，由此建立的數(shù)學模型擬合度較好。

③ RNN、RUN、PUN濃度以及UUN日排泄量與牦牛蛋白質(zhì)攝入水平密切相關，由此建立的數(shù)學模型可為估測放牧牦牛CPI及DCPI提供參考。

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