絡(luò)合萃取降低三七中的重金屬及其萃取前后形態(tài)分析

譚禮浩 賀麗蘋，2 曹 庸 陳 彤 李文治 朱萬軍 陳洪章

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測(cè)試中心，廣東 廣州 510642；3.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510665）

三七（panax notoginseng）屬五加科人參屬多年生草本植物，其根入藥，又名田七，是中國特有的名貴中藥材，明代著名藥學(xué)家李時(shí)珍稱其為“金不換”。主產(chǎn)于中國云南、廣西，具有散瘀止血，消腫定痛等功效［1］。三七含有多種化學(xué)成分，主要有效成分之一是三七皂苷類（以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1為主），除此之外還包含揮發(fā)油、三七素、黃酮類、甾醇、糖類等有效物質(zhì)［2，3］。

由于污染防治意識(shí)和技術(shù)的落后，近年來，金屬尤其是重金屬對(duì)土壤和水體的污染問題逐漸凸顯，隨之發(fā)生了大量農(nóng)作物、魚類的重金屬污染問題。在“鎘大米”問題發(fā)現(xiàn)之前，中藥材的重金屬污染就已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一。中藥材重金屬污染來源主要有兩條途徑：① 自然界環(huán)境的污染，包括土壤、水、大氣等帶來的影響；② 藥材的炮制、貯藏和運(yùn)輸過程中外源性的重金屬鹽的引入。這些外源性重金屬離子在中藥提取過程中，可能隨著有效成分的提取、濃縮不斷轉(zhuǎn)移、富集，進(jìn)而導(dǎo)致制劑中重金屬超標(biāo)［4］。所以，對(duì)中藥材進(jìn)行必要的處理，使其重金屬控制在限量標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi)，保證用藥安全十分重要。

近年來，對(duì)中藥材重金屬降低方法的研究越來越多，例如大孔樹脂吸附法、超臨界CO2萃取法［5］、殼聚糖吸附法［6］、麥飯石吸附法［7］、超濾技術(shù)［8］等等，但由于受限于工藝條件不容易實(shí)現(xiàn)、有效出成分損失較大、重金屬降低效果不好等因素，難以大范圍應(yīng)用。

Wai C M［9］、Foy G P［10］、Abd El－Fatah S［11］等利用超臨界降低固體樣本中重金屬方面的試驗(yàn)為本研究提供了一個(gè)絡(luò)合萃取方面的思路，即在低極性溶劑中加入一定量極性溶劑起改性作用，再配合金屬絡(luò)合劑，在10～25MPa高壓條件下萃取固體樣本中重金屬離子。本研究在此基礎(chǔ)上提出，能否模擬超臨界流體萃取重金屬的條件，在常壓情況下達(dá)到降低三七中重金屬的目的，所以本研究以溶劑a和溶劑b作為混合溶劑，嘗試不同的配合劑來降低三七中重金屬含量并優(yōu)化相關(guān)的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

三七：粉碎后過80目篩，四川新荷花中藥飲片股份有限公司；

溶劑a、溶劑b、乙酸乙酯：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

配合劑c、植酸、單寧酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉（NaDDC）：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

殼聚糖：分析純，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國J.T.Baker公司；

過氧化氫、硝酸：優(yōu)級(jí)純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：AUY220型，日本島津公司；

數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋：HH－2型，金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；

原子吸收分光光度計(jì)：AA800型，美國PerkinElmer公司；

微波消解儀：Ethos One型，意大利Milestone公司；

高效液相色譜儀：LC－10ATVPplus型，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三七中重金屬含量檢測(cè) 三七磨粉，過40目篩，混合均勻后取0.5g置于消解罐中，加入6mL硝酸和2mL過氧化氫，于微波消解儀中消解。消解完畢轉(zhuǎn)移、定容后上機(jī)檢測(cè)。樣品中重金屬Pb2＋、Cd2＋的檢測(cè)方法參考 GB/T 5009.12—2003《食品中鉛的測(cè)定》、GB/T 5009.15—2003《食品中鎘的測(cè)定》及文獻(xiàn)［12］。

1.2.2 三七中有效成分檢測(cè)

（1）混合對(duì)照品的制備：精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含人參皂苷Rg10.4mg，人參皂苷 Rb10.4mg，三七皂苷 R10.1mg的混合溶液，即得。

（2）供試品的制備：取三七粉末（過四號(hào)篩）0.6g，精密稱定，精密加入甲醇50mL，稱定重量，放置過夜，水浴保持微沸2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）色譜條件的選擇［13］：色譜柱為Dikma C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相 A為水，流速1.5mL/min，檢測(cè)波長203nm；按表1中的程序進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 溶劑與絡(luò)合劑的選擇 配置5份溶劑a（70%）與溶劑b（30%）的混合溶劑，每份50mL，各取5.0g三七粉置于其中，分別加入1g殼聚糖、配合劑c、NaDDC、單寧酸、植酸，混合均勻加入磁力攪拌子置于60℃水浴鍋中反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后用紗布過濾，將物料于5 0℃烘至水分含量5%以下，取適量消解檢測(cè)并測(cè)定有效成分。

1.2.4 溶劑比例的影響 取一定量三七混合均勻，平均分成5g/份置于5個(gè)錐形瓶中，分別將3，5，9，12，50份溶劑a與1，1，1，1，0份溶劑b混合，配制成5份50mL混合溶劑置于各個(gè)錐形瓶中，各錐形瓶中加入1g配合劑c，再加入磁力攪拌子，置于磁力攪拌水浴鍋，設(shè)置反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間3h，反應(yīng)完畢后用紗布過濾，將物料于50℃烘至水分含量5%以下，取適量消解檢測(cè)并測(cè)定有效成分。

1.2.5 反應(yīng)溫度的影響 取一定量三七混合均勻，平均分成5g/份置于5個(gè)錐形瓶中，將6份溶劑a與1份溶劑b混合，配制成5份50mL混合溶劑置于各個(gè)錐形瓶中，各錐形瓶中加入1g配合劑c，再加入磁力攪拌子，置于磁力攪拌水浴鍋，分別設(shè)置反應(yīng)溫度為20，30，40，50，60℃，反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后用紗布過濾，將物料于50℃烘至水分含量為5%以下，取適量消解檢測(cè)并測(cè)定有效成分。

1.2.6 反應(yīng)時(shí)間的影響 取一定量三七混合均勻，平均分成5g/份置于5個(gè)錐形瓶中，分別將6份溶劑a與1份溶劑b混合，配制成5份50mL混合溶劑置于各個(gè)錐形瓶中，各錐形瓶中加入1g配合劑c，再加入磁力攪拌子，置于磁力攪拌水浴鍋，設(shè)置反應(yīng)溫度為50℃，分別反應(yīng)1，2，3，4，5h，反應(yīng)完畢后用紗布過濾，將物料于50℃烘至水分含量5%以下，取適量消解檢測(cè)并測(cè)定有效成分。

1.2.7 絡(luò)合劑添加量的影響 取一定量三七混合均勻，平均分成5g/份置于5個(gè)錐形瓶中，分別將6份溶劑a與1份溶劑b混合，配制成50mL混合溶劑置于5個(gè)錐形瓶中，其中分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0g配合劑c，將錐形瓶中各加入磁力攪拌子，置于磁力攪拌水浴鍋，分別設(shè)置反應(yīng)溫度為50℃，均反應(yīng)3h，反應(yīng)完畢后用紗布過濾，將物料于5 0℃烘至水分含量5%以下，取適量消解檢測(cè)并測(cè)定有效成分。

1.2.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溶劑比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、絡(luò)合劑添加量這4個(gè)因素及其對(duì)應(yīng)的3個(gè)較優(yōu)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以Pb2＋、Cd2＋降低率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.2.9 初級(jí)形態(tài)分析 參考化學(xué)試劑逐步提取法［14，15］，準(zhǔn)確稱取一定量三七粉，分別順序加入提取劑80%乙醇、去離子水、1mol/L NaCl、2%醋酸和0.6mol/L鹽酸10mL，在30℃下振蕩提取1h，重復(fù)提取3次，合并每一級(jí)3次提取液共3 0mL，電熱板上蒸干，消解，檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 三七中Pb2＋ 、Cd2＋ 及有效成分檢測(cè)

三七樣品經(jīng)石墨爐原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)得出其Pb2＋、Cd2＋含量分別為823，351μg/kg；中國目前尚沒有對(duì)中藥材制定相應(yīng)的重金屬限量國標(biāo)，參考《中國藥典》［16］等，中藥中Pb2＋、Cd2＋限量為500，300μg/kg。三七中 Pb2＋含量明顯高于限量標(biāo)準(zhǔn)，Cd2＋含量也在限量標(biāo)準(zhǔn)以上，可見三七對(duì)重金屬Pb2＋、Cd2＋富集能力較強(qiáng)，且有必要對(duì)其進(jìn)行一定的處理。

圖1中1、2、3號(hào)分別為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷 R1，三者在樣品中含量分別為2.48%，4.65%，1.17%，即三七中總皂苷含量為8.20%。

圖1 三七液相圖譜Figure 1 The chromatogram of panax notoginseng

2.2 溶劑與絡(luò)合劑的選擇

由圖2（a）可知，配合劑c、NaDDC處理組與三七原料Pb2＋含量有極顯著的差異，分別降低了16.27%與35.74%，而殼聚糖處理組有一定的效果，達(dá)到了4.13%，其他組別均不顯著；由圖2（b）可知，三七經(jīng)殼聚糖、配合劑c、單寧酸與NaDDC組處理后，Cd2＋含量均有顯著性的降低，其中配合劑c與NaDDC對(duì)Cd2＋的降低效果較好，分別降低了17.31%與19.32%。綜合比較發(fā)現(xiàn)，NaDDC處理降低三七中重金屬含量的效果最好，其次是配合劑c，考慮到NaDDC添加入食品中，其安全性未能確定，故選擇配合劑c作為絡(luò)合劑來進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 不同絡(luò)合劑處理組處理后Pb2＋、Cd2＋含量的變化Figure 2 Change of lead content and cadmium content treat by different complexing agent

2.3 溶劑比例的影響

前期進(jìn)行的試驗(yàn)已經(jīng)確定極性較大的溶劑b在此反應(yīng)條件下并沒有很好的重金屬降低效果，所以把溶劑a與溶劑b體積比例確定在3∶1～50∶0，在此范圍內(nèi)，溶劑極性逐漸降低。由圖3可知，在溶劑比例為3∶1～6∶1時(shí)，Pb2＋降低率顯著提高，在最高點(diǎn)6∶1處達(dá)到了最高點(diǎn)，降低率達(dá)到了20.27%；隨著溶劑極性的降低，Pb2＋降低率明顯下降；而Cd2＋降低率隨著溶劑極性變小逐漸降低，在3∶1處達(dá)到了最高點(diǎn)21.15%；三七中功效成分三七總皂苷經(jīng)液相色譜檢測(cè)得知，隨著溶劑極性逐漸變小其存留率逐漸升高，總皂苷存留率最低點(diǎn)出現(xiàn)在3∶1處（為80.21%），可見溶劑極性對(duì)三七存留率有較大的影響。

圖3 溶劑比例對(duì)重金屬降低以及有效成分的影響Figure 3 Effect of solvent ratio on effective components and reduced rate of heavy metals

參考C.M.Wai等［9－11］在超臨界萃取重金屬離子方面的研究結(jié)果，在低極性的溶劑中加入一定量的高極性溶劑用于改性更加有利于重金屬的萃取，其原因?yàn)榕浜蟿ヽ在此體系中更容易與重金屬絡(luò)合且絡(luò)合物有更好的溶解度，更容易與物料進(jìn)行分離。

2.4 反應(yīng)溫度的影響

由圖4可知，在20～50℃時(shí)，Pb2＋降低率逐漸升高，5 0℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)（21.37%），隨后緩慢降低，基本保持平衡狀態(tài)；在20～40℃時(shí)，Cd2＋降低率逐漸升高，40℃時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)（23.31%），隨后降低率逐漸降低；而三七總皂苷存留率隨著溫度的升高緩慢降低，60℃時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)為8 8.25%，說明反應(yīng)溫度對(duì)于三七總皂苷的影響并不顯著。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因?yàn)椋涸诖朔磻?yīng)體系一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高，反應(yīng)的速度和反應(yīng)的程度有所提高，絡(luò)合劑對(duì)Pb2＋和Cd2＋的吸附更加徹底。

2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)重金屬降低以及有效成分的影響Figure 4 Effect of reaction temperature on effective components and reduced rate of heavy metals

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)重金屬降低以及有效成分的影響Figure 5 Effect of reaction time on effective components and reduced rate of heavy metals

由圖5可知，反應(yīng)時(shí)間在1～5h時(shí)，Pb2＋降低率緩慢升高，5h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)（24.75%）；而Cd2＋降低率在1～5h時(shí)有一定的浮動(dòng)，變化趨勢(shì)不大。三七總皂苷在此過程中存留率隨著反應(yīng)時(shí)間增加而降低，反應(yīng)時(shí)間對(duì)總皂苷存留率的影響較大，最低點(diǎn)出現(xiàn)在反應(yīng)時(shí)間5h時(shí)（82.21%）。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，絡(luò)合劑與Pb2＋、Cd2＋的結(jié)合更加徹底，但到一定程度達(dá)到飽和，Pb2＋和Cd2＋的降低率就會(huì)維持在一定水平不再上升。

2.6 絡(luò)合劑添加量的影響

由圖6可知，當(dāng)絡(luò)合劑添加量在0g時(shí)，Pb2＋、Cd2＋降低率較低，隨著絡(luò)合劑量添加量增加降低率顯著提高；Pb2＋、Cd2＋降低率在2g時(shí)分別達(dá)到最高點(diǎn)（30.53%，33.86%）。三七總皂苷在此范圍內(nèi)緩慢下降，說明絡(luò)合劑的增加對(duì)皂苷會(huì)有一定的影響，絡(luò)合劑達(dá)到2g時(shí)，存留率為83.21%。

圖6 絡(luò)合劑添加量對(duì)重金屬降低以及有效成分的影響Figure 6 Effect of the amount of complexing agent on effective components and reduced rate of heavy metals

2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溶劑比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、絡(luò)合劑添加量這4個(gè)因素及其對(duì)應(yīng)的3個(gè)較優(yōu)水平（表2），采用 L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)絡(luò)合萃取三七中 Pb2＋和Cd2＋工藝條件作進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，4因素對(duì)絡(luò)合萃取三七中Pb2＋的影響大小為D＞A＞B＞C，比較4個(gè)因素不同水平下的組合，發(fā)現(xiàn)理論最優(yōu)方案為A1B3C1D3，即溶劑比例為4∶1，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為2h，絡(luò)合劑添加量為2g；四因素對(duì)絡(luò)合萃取三七中Cd2＋的影響大小為D＞B＞A＞C，比較4個(gè)因素不同水平下的組合，發(fā)現(xiàn)理論最優(yōu)方案為A1B3C1D3。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 L9（34）Factors and levels of orthogonal test

表3 三七Pb2＋、Cd2＋降低正交優(yōu)化結(jié)果與極差分析Table 3 Orthogonal optimization results and range analysis of reducingthe content of lead and cadmium on panax notoginseng（n＝2）

由于上述正交試驗(yàn)中并沒有最優(yōu)組合，因此還需追加試驗(yàn)確認(rèn)最優(yōu)組合的Pb2＋降低率與Cd2＋降低率，對(duì)最優(yōu)組合和正交試驗(yàn)最大值A(chǔ)1B3C3D3組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示最優(yōu)組合的Pb2＋降低率為42.68%，Cd2＋降低率為37.07%，均大于正交試驗(yàn)最大值組，符合試驗(yàn)結(jié)果。因此可以確定Pb2＋降低率與Cd2＋降低率最優(yōu)條件為A1B3C1D3。

因反應(yīng)時(shí)間影響不顯著，所以把反應(yīng)時(shí)間作誤差列。由表4、5可知：溶劑比例與絡(luò)合劑添加量對(duì)三七Pb2＋的降低有顯著性影響（P＜0.05）；溶劑比例對(duì)三七Cd2＋的降低有極顯著性影響（P＜0.01），而其他因素在此區(qū)間內(nèi)影響不顯著。

2.8 化學(xué)形態(tài)分析

提取劑極性由小到大，不同極性的提取劑所提取樣品中重金屬的形態(tài)不同，80%乙醇主要提取硝酸Pb2＋（硝酸Cd2＋）、氯化物為主的Pb2＋鹽（Cd2＋鹽），去離子水主要提取水溶性有機(jī)酸Pb2＋鹽（Cd2＋鹽），氯化鈉主要提取果膠酸鹽、與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或吸附態(tài)的Pb2＋（Cd2＋）等，醋酸主要提取難溶于水的Pb2＋磷酸鹽（Cd2＋磷酸鹽），鹽酸主要提取草酸Pb2＋鹽（Cd2＋鹽）等［14，15］。形態(tài)本身說明了重金屬在植物體內(nèi)與各種基團(tuán)的結(jié)合情況，隨著提取溶劑極性的增強(qiáng)，所提取出的Pb2＋（Cd2＋）活性是不斷降低的，與植物基質(zhì)的結(jié)合程度也越來越牢固。

表4 三七Pb2＋降低正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of orthogonal experiment to reducethe content of lead and cadmium on panax notoginseng

表5 三七Cd2＋降低正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of orthogonal experiment to reduce the content of cadmium on panax notoginseng

由表6可知，對(duì)于Pb2＋而言，NaCl提取態(tài)與鹽酸提取態(tài)含量分別占總量31.61%和24.62%，三七處理組與對(duì)照組相比降低的Pb2＋主要以NaCl提取態(tài)與鹽酸提取態(tài)形式存在，分別降低了124μg/kg和104μg/kg，去離子水提取態(tài)、80%乙醇提取態(tài)與醋酸提取態(tài)均有一定程度的降低；對(duì)于Cd2＋而言，NaCl提取態(tài)與醋酸提取態(tài)含量分別占總量32.93%和46.79%，三七處理組與三七對(duì)照組相比降低的Cd2＋離子主要以NaCl提取態(tài)與醋酸提取態(tài)形式存在，分別降低了33μg/kg和86μg/kg，其他提取態(tài)降低趨勢(shì)不顯著。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)絡(luò)合劑添加量與溶劑比例對(duì)三七中重金屬降低率有著決定性的影響，經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化三七重金屬Pb2＋降低率最高能達(dá)到38.11%，Cd2＋重金屬降低率最高能達(dá)到36.75%，同時(shí)總皂苷存留率良好，處理后的三七中Cd2＋含量降低至限量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，Pb2＋含量達(dá)到了限量標(biāo)準(zhǔn)；形態(tài)分析試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絡(luò)合萃降低三七中的Pb2＋主要以NaCl提取態(tài)與鹽酸提取態(tài)形式存在，絡(luò)合萃取法降低三七中的Cd2＋主要以NaCl提取態(tài)與醋酸提取態(tài)形式存在。國外有學(xué)者［17－19］對(duì)絡(luò)合萃取開展了一定的研究，但大多集中于降低煤渣、廢水中重金屬，提取貴金屬、稀有金屬等，未有發(fā)現(xiàn)應(yīng)用在食品方面的，且所用的溶劑多為食品中不允許添加的。本研究采用絡(luò)合萃取方法降低三七中重金屬，所用溶劑和絡(luò)合劑均為食品助劑或食品添加劑，處理后殘留量極低，且重金屬降低較好，有效成分存留率理想，故具有一定的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

表6 三七中Pb2＋、Cd2＋化學(xué)形態(tài)分Table 6 Speciation analysis of lead and cadmium in panax notoginseng

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