孔凌云 史詠華 吳 煒 邵 偉

（1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443001；2.河南南街村集團(tuán)技術(shù)中心，河南 臨穎 462600）

中國(guó)是釀酒大國(guó)，其發(fā)酵液及其酵母壁原料多，一般用作飼料或廢棄［1］。啤酒廢酵母是提取多種生化物質(zhì)及生化藥物的寶貴資源［2］。酵母細(xì)胞壁主要由β－葡聚糖和甘露聚糖組成，甘露聚糖占酵母細(xì)胞壁干重的40%左右［3］。甘露聚糖具有增加動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫能力，能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，選擇性吸附霉菌毒素，具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤，改善血清脂質(zhì)，降低膽固醇含量，防止便秘，改善多種消化系統(tǒng)疾病等功能，是一種極具市場(chǎng)潛力的食品添加劑［4，5］。甘露聚糖目前在食品工業(yè)中作為膠凝劑、增稠劑和保水劑而被廣泛應(yīng)用［6］。采用全細(xì)胞制備酵母多糖的傳統(tǒng)方法具有酸堿用量大、回收成本高，容易破壞多糖結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)［7－10］，不利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。目前，以啤酒廢酵母為原料提取甘露聚糖的工藝存在用堿量過多、收率低、成本高等方面的不足。因此，優(yōu)化與改進(jìn)現(xiàn)有工藝條件就顯得尤為重要。為此，本研究擬采用正交試驗(yàn)方法，以甘露聚糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以自溶后的酵母細(xì)胞壁為原料，優(yōu)化建立甘露聚糖提取工藝，以期提高提取率、減輕后期的純化壓力，而且降低堿的用量，減少對(duì)多糖的降解，使其保持較高生理活性，以期為啤酒廢酵母甘露聚糖的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮啤酒酵母：由河南南街村集團(tuán)南德啤酒廠提供；甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司；

其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

電子天平：ALC-210.4型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司；

pH計(jì)：pHS-3C型，上海雷磁儀器廠；

高壓均質(zhì)機(jī)：SRH60-70型，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-30SII型，上海博迅實(shí)業(yè)實(shí)限有限公司；

離心機(jī)：TGL-20LM型，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；

紫外－可見分光光度計(jì)：Varian Cary50型，美國(guó)瓦里安技術(shù)公司。

1.3 甘露聚糖提取方法

1.3.1 甘露聚糖提取工藝

啤酒廢酵母→預(yù)處理→自溶→均質(zhì)→NaOH提取→脫蛋白→乙醇醇析→乙醚、丙酮洗滌→干燥→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）啤酒廢酵母的預(yù)處理：按1∶1（V∶V）的比例將純凈水加入啤酒廢酵母泥中進(jìn)行洗滌，并經(jīng)100目篩子過篩，然后以3 000r/min離心10min，如此3次，以除去其中的酒花等雜質(zhì)［11，12］，收集洗凈的酵母泥。

（2）自溶：稱取一定量的酵母泥，按料水比1∶4（m∶m）的比例加入純凈水，制成酵母懸液，添加適量2%NaCl、p H 4.5的醋酸—醋酸鈉緩沖液，于45～50℃保溫?cái)嚢枳匀? 8h。

（3）均質(zhì)：將自溶液以3 000r/min離心10min，得沉淀物，按料水比1∶3（m∶m）的比例加入純凈水，制成酵母細(xì)胞壁懸液，在40MPa條件下進(jìn)行均質(zhì)處理（均質(zhì)進(jìn)料溫度70℃），再以3 000r/min離心10min，得酵母細(xì)胞壁沉淀物。

（4）提?。悍Q取酵母細(xì)胞壁，添加不同質(zhì)量濃度的NaOH配成不同的料液比，并在不同的溫度及時(shí)間下浸提，3 000r/min離心10min取上清液，用20%的醋酸溶液中和至pH 7.0，攪拌10min，離心取上清液。

（5）脫蛋白：將提取后獲得的含甘露聚糖的上清液中加入10%濃度的三氯乙酸溶液，調(diào)pH為3，4℃冰箱冷藏靜置過夜，離心脫蛋白。

（6）精制干燥：向脫蛋白后的溶液中加入2倍體積無(wú)水乙醇過夜，離心取沉淀物，分別用乙醚、丙酮洗滌，60℃干燥得甘露聚糖成品。

1.4 試驗(yàn)方法

（1）料液比的影響：取2.5g酵母細(xì)胞壁各5份，添加3%的 NaOH分別制成料液比為1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶17.5，1∶20（m∶V）的懸浮液于90℃浸提2h，測(cè)甘露聚糖含量。

（2）NaOH濃度的影響：取2.5g酵母細(xì)胞壁各5份，分別添加濃度為1%，2%，3%，4%，5%的NaOH配成料液比1∶15（m∶V）的懸浮液，90℃浸提2h，測(cè)甘露聚糖含量。

（3）浸提時(shí)間的影響：取2.5g酵母細(xì)胞壁各5份，添加濃度為3%的NaOH制成料液比為1∶15（m∶V）的懸浮液，于90℃分別浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，測(cè)甘露聚糖含量。

（4）浸提溫度的影響：取2.5g酵母細(xì)胞壁各5份，添加濃度為3%的NaOH配成料液比為1∶15（m∶V）的懸浮液，分別于60，70，80，90，100℃下浸提2h，測(cè)甘露聚糖含量。

1.5 測(cè)定方法

（1）甘露聚糖含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)［13］，以紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

（2）樣品處理：稱取20mg左右的酵母甘露聚糖，碾磨溶解于2.5mL 72%H2SO4中，室溫放置3h，加蒸餾水使硫酸的最終濃度為4mol/L左右，然后100℃酸水解4h，取出冷卻至室溫，用 NaOH調(diào)pH至中性，再用0.2mol/L p H 7.0磷酸緩沖液定容至100mL。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：參照文獻(xiàn)［13］的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）樣品甘露聚糖濃度的測(cè)定：吸取0.2mL樣液，參照文獻(xiàn)［13］的方法于280nm測(cè)吸光值，求得△OD，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算甘露糖濃度，從而得出甘露聚糖濃度。

（5）甘露聚糖提取率的計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品，紫外分光光度法測(cè)定其吸光度，繪制的甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of mannose

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.001 5x－0.027 07（y為△OD，x為甘露糖質(zhì)量濃度μg/mL），相關(guān)系數(shù)R2＝0.996 3。

2.2 料液比對(duì)甘露聚糖提取率的影響

圖2 料液比對(duì)甘露聚糖提取率的影響Figure 2 Effects of different solid-liquid ratio on the extraction rate of mannan

由圖2可知，當(dāng)料液比小于1∶15（m∶V）時(shí)，甘露聚糖提取率隨料液比的增加而增加；當(dāng)料液比為1∶15（m∶V）時(shí)，甘露聚糖提取率最大，說明在料液比較低時(shí)，提取液尚未充分發(fā)揮作用，堿提不徹底；料液比高于1∶15（m∶V）時(shí)，提取液不足，影響提取效果。因此，以1∶15（m∶V）為提取甘露聚糖的較佳料液比。

2.3 NaOH濃度對(duì)甘露聚糖提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)NaOH添加量小于2%時(shí)，由于堿的水解，使可溶性的甘露聚糖溶出，低濃度堿對(duì)甘露聚糖的提取具有促進(jìn)作用；當(dāng)NaOH添加量大于2%時(shí)，提取出的甘露聚糖被高濃度的堿降解，而且堿濃度越大對(duì)甘露聚糖的破壞越厲害，損失也越大。故選擇質(zhì)量濃度2%的NaOH作為提取啤酒廢酵母甘露聚糖的添加量。

圖3 NaOH濃度對(duì)甘露聚糖提取率的影響Figure 3 Effects of different concentration of NaOH on the extraction rate of mannan

2.4 浸提時(shí)間對(duì)甘露聚糖提取率的影響

由圖4可知，浸提時(shí)間小于1.5h時(shí)，NaOH發(fā)揮水解作用，使細(xì)胞壁上的甘露聚糖溶出，但由于時(shí)間較短，提取尚未結(jié)束，所以呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)浸提時(shí)間大于1.5h時(shí)，隨著堿提時(shí)間的延長(zhǎng)，甘露聚糖降解，提取率降低。因此，選擇1.5h作為提取甘露聚糖的浸提時(shí)間。

2.5 浸提溫度對(duì)甘露聚糖提取率的影響

由圖5可知，浸提溫度不同，甘露聚糖提取率也不同。當(dāng)溫度低于90℃時(shí)，甘露聚糖提取率隨溫度的升高呈上升趨勢(shì)，說明在溫度比較低的時(shí)候反應(yīng)不徹底，堿提不充分；溫度高于9 0℃時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，堿提過程中溶出的甘露聚糖又會(huì)被降解，破壞多糖結(jié)構(gòu)，使提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選擇9 0℃為提取甘露聚糖的浸提溫度。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)甘露聚糖提取率的影響Figure 4 Effects of different time on the extraction rate of mannan

圖5 浸提溫度對(duì)甘露聚糖提取率的影響Figure 5 Effects of different rate of mannan

2.6 甘露聚糖提取工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、NaOH濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度等因素進(jìn)行考察，并以甘露聚糖提取率為考察指標(biāo)，建立正交試驗(yàn)因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The design of the head of table L9（34）

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 L9（34）orthogonal array design arrangement and experimental results

由表2可知，影響甘露聚糖提取效果因素的主次順序?yàn)椋篋＞A＞C＞B，通過極差分析可以確定甘露聚糖提取工藝的最佳條件為 A3B2C1D3，即料液比為1∶17.5（m∶V），NaOH濃度為2%，浸提時(shí)間為1.0h，浸提溫度為9 0℃。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

＊ 差異顯著（P＜0.05）。

來(lái)源 偏差平方和 自由度 F比 顯著性（α＝0.05）A 24.084 2 0.973＊ 99.02 8 B 10.071 2 0.407 C 22.260 2 0.899 ＊D 42.605 2 1.721 ＊誤差

由表3可知，因素A、C和D在P＜0.05的水平上有顯著性差異，因素B不顯著。

2.7 最佳提取條件的驗(yàn)證

根據(jù)確定的甘露聚糖提取最佳工藝條件，對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行甘露聚糖提取，做3次平行提取實(shí)驗(yàn)，并對(duì)所提取的甘露聚糖進(jìn)行含量測(cè)定，其甘露聚糖平均提取率可達(dá)到1 8.15%，低于表2中試驗(yàn)8的18.88%的提取率，說明試驗(yàn)中存在一定的試驗(yàn)誤差、各因素間存在交互作用。

3 結(jié)論

本研究以啤酒廢酵母為原料，通過單因素試驗(yàn)，考察了不同料液比、NaOH濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)酵母甘露聚糖提取效果的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了L9（34）正交試驗(yàn)，確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶17.5（m∶V），NaOH濃度2%，浸提時(shí)間1.0h，浸提溫度90℃。在此條件下制備甘露聚糖，所得甘露聚糖平均提取率為18.15%。由此可見，以自溶后的酵母細(xì)胞壁為試材提取甘露聚糖，不僅操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)廉價(jià)，而且減少了堿的用量，提高了提取率，這與梁新樂等［5］使用濃度6%的NaOH，甘露聚糖提取率6.63%相比，堿用量降低了4%，而提取率提高了3倍左右；與朱紅蕾等［8］使用濃度5%的NaOH，甘露聚糖提取率4.4%相比，堿用量降低了3%，提取率提高了4倍左右。該方法在操作上減少了堿的用量，提高了啤酒廢酵母甘露聚糖的提取率，可做為工業(yè)化生產(chǎn)酵母甘露聚糖的技術(shù)參考。

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