張寒，李鋒麗，馬亞榮，劉文娟，楊光華，譚汗青，文和，張蓉，杜強(qiáng)

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

青莢葉(Helwingia japonica)為山茱萸科青莢葉屬，因花著生于葉上面的中脈(近于基部)，又稱葉上珠、葉上花。其根莖葉入藥，具有舒筋活絡(luò)、調(diào)經(jīng)、清熱除濕、解毒消腫、涼血止血、清肺止咳等功效，并具有清熱利尿、下乳等功能［1］。青莢葉中含有的植物甾醇類成分是植物中的一種活性成分，在結(jié)構(gòu)上與動(dòng)物性甾醇如膽甾醇相似，是一種類似于環(huán)狀醇結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有降低膽固醇的作用［2］，然而針對(duì)青莢葉中植物甾醇的研究在國(guó)內(nèi)卻是很少見(jiàn)的。

植物甾醇提取及定量分析方法的研究報(bào)道［3-5］很多，本實(shí)驗(yàn)采用磷硫鐵作為顯色劑［5］測(cè)定青莢葉中植物甾醇的含量，采用正交實(shí)驗(yàn)法，以豆甾醇的含量為指標(biāo)，通過(guò)紫外分光光度法對(duì)青莢葉中植物甾醇的含量進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化青莢葉中皂化提取物的提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

青莢葉，陜西眉縣太白山采用;豆甾醇(純度≥95%);乙醇、石油醚、氫氧化鉀、三氯甲烷、三氯化鐵、濃磷酸、濃硫酸等均為分析純。

UC-2102C/PC/PCS 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);GR202 微量天平;SENCOR 系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;SXKW數(shù)顯控溫電熱套;SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵;KQ-300B 型超聲波清洗器;503N 型恒溫水浴鍋。

1.2 溶液配制

1.2.1 豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取豆甾醇標(biāo)樣5 mg，溶于無(wú)水乙醇中，定容至10 mL，豆甾醇含量為0.500 mg/mL，貯于棕色瓶中，低溫保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)吸取上述儲(chǔ)備液2.5 mL，用無(wú)水乙醇定容至25 mL，得豆甾醇使用液，含量為50 μg/mL。

1.2. 2 磷硫鐵顯色劑配制 稱取10 g FeCl3·6H2O 溶于85%濃磷酸中，用磷酸定容至100 mL。貯于棕色瓶中，冷藏，可保存1 年。再取上述配好的10% FeCl3液1.5 mL 于100 mL 棕色瓶中，用濃硫酸定容至刻度。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6-7］

取20 mL 干燥試管6 支編號(hào)，分別按表1 添加試劑。而后在室溫下顯色15 min，在445 nm 下用分光光度計(jì)分別測(cè)定吸光度，以豆甾醇量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸，得回歸方程:Y=0.001 2X－0.007 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3，說(shuō)明該方法線性良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑繪制參數(shù)Table 1 Stigmatization parameters of standard curve

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白調(diào)基準(zhǔn)，在350 ～700 nm 范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 紫外吸收波譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum

由圖1 可知，在445 nm 和550 nm 處有2 個(gè)吸收峰，根據(jù)峰高我們選擇445 nm 作為測(cè)定吸收波長(zhǎng)。

1.4 青莢葉提取［8］

稱取青莢葉細(xì)粉(過(guò)40 目篩)約10 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，加入氯仿60 mL，加熱回流提取2 h，放冷，過(guò)濾，殘?jiān)性偌勇确?0 mL，回流提取2 h，放冷，過(guò)濾。合并濾液，減壓濃縮至干。殘?jiān)尤?0%的氫氧化鉀乙醇溶液60 mL，于80 ℃回流皂化90 min，以石油醚萃取4 次，每次60 mL，合并有機(jī)相，揮干溶劑，得青莢葉提取物。

1.5 青莢葉中植物甾醇含量測(cè)定［9］

準(zhǔn)確稱取提取物0.4 ～0.45 g，用無(wú)水乙醇溶解后定容至50 mL。取樣品液4 mL，加入無(wú)水乙醇4 mL，磷硫鐵顯色劑4 mL，搖勻，15 min 后用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)445 nm 處測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 青莢葉中甾醇最佳提取條件的確定

單因素實(shí)驗(yàn)表明，料液比、KOH-乙醇濃度、皂化時(shí)間和萃取劑用量對(duì)甾醇的提取工藝影響最大。選用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以確定提取甾醇的最佳工藝參數(shù)，因素水平見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 因素水平Table 2 Factors and levels

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

由表3 可知，堿濃度對(duì)粗甾醇的提取率影響最大。最佳因素組合為A3B1C2D3，即提取不皂化物時(shí)，加入提取劑60 mL，料液比1 ∶6(g/mL)，氫氧化鉀-乙醇溶液濃度為10%，在溫度80 ℃下皂化90 min，此時(shí)甾醇的提取率最高。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

精密稱取3 份青莢葉藥材，在最佳條件下操作，平行制備3 份樣品溶液，每份測(cè)定3 次，取其平均值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 青莢葉中植物甾醇的吸光度(n=3)Table 4 Absorbance of sterol from Helwingia japonica

由表4 可知，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取工藝提取的甾醇吸光度值高于正交表中9 次實(shí)驗(yàn)的任一值。故可以確定此條件為最佳條件。

2.3 穩(wěn)定性測(cè)定

精密吸取樣品溶液4 mL，分別顯色5，10，15，20，25，30 min 后，在445 nm 測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD=1.24%，表明樣品溶液顯色后較穩(wěn)定，在30 min內(nèi)均可進(jìn)行測(cè)定。

2.4 精密度的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取樣品溶液3. 00 mL 分別置于9 支20 mL 試管中，測(cè)定吸光度，結(jié)果平均吸光度為0.342，標(biāo)準(zhǔn)偏差S =0. 000 432 8，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.126 5%，說(shuō)明此方法的精密度高或重現(xiàn)性好。

2.5 回收率的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取樣品溶液3. 00 mL 分別置于6 只20 mL 試管中，其中 3 管中加入豆甾醇標(biāo)樣3.00 mL，另3 管加入豆甾醇標(biāo)樣4.00 mL，測(cè)定吸光度。結(jié)果樣品回收率為98.5% ～103.7%，平均回收率為101.6%，可以滿足分析測(cè)定的需要。

3 結(jié)論

(1)濕法皂化提取植物甾醇的優(yōu)化工藝為:將10 g 青莢葉粉末溶于60 mL 氯仿中，50 ℃回流2 h，并減壓蒸干，重復(fù)2 次，殘?jiān)尤?0%的氫氧化鉀-乙醇飽和溶液在沸水浴中皂化反應(yīng)90 min，用石油醚60 mL 萃取4 次，合并有機(jī)相，揮干溶劑。此時(shí)植物甾醇的提取率最高。

(2)利用甾醇類化合物與酸作用時(shí)，經(jīng)脫水生成雙鍵而產(chǎn)生顏色物質(zhì)的原理，采用磷硫鐵試劑作為顯色劑，與甾醇發(fā)生顯色反應(yīng)，建立了青莢葉粉末中植物甾醇的分光光度測(cè)定方法。該法測(cè)定植物甾醇，有較好的穩(wěn)定性、精密度和回收率，操作方法簡(jiǎn)便，并且靈敏度較高，可用于植物甾醇的生產(chǎn)管理和產(chǎn)品質(zhì)量的分析工作中。

［1］ 李雙妹.青莢葉多糖的提取及含量測(cè)定［J］.溫州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，10(2):49-52.

［2］ Kevin B Hicks，Robert A Moreau. Phytosterols and phytosterols:Fuctional food cholesterol busters［J］. Food Technology，2001，55(1):63-67.

［3］ 李英霞，王鳳云. 可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定大豆甾醇提取物中總甾醇的含量［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9(5):154-155.

［4］ 阮棟梁，楊曉靜，李和. 沙棘葉中甾醇的分離與鑒定［J］.沙棘，2004，17(3):18-21.

［5］ 彭麗霞，朱億竹，魏陽(yáng)吉，等. 葡萄籽油中植物甾醇的提取與鑒定［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12(3):185-191.［6］ 劉蕾，陳星，李曉麗，等. 分光光度計(jì)法測(cè)定大豆總甾醇含量的研究［J］.中國(guó)油脂，2005，30(4):45-47.

［7］ 李永輝，李海龍，譚銀豐，等. 番木瓜籽中總甾醇的含量測(cè)定［J］.海南醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，18(9):1223-1225.

［8］ 高政，劉曉宇，李江飛，等. 菜籽毛油提取植物甾醇的研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2007(11):31-34.

［9］ 劉海霞，王峰，趙雁武，等. 蘋(píng)果籽油中植物甾醇的提取及分光光度法含量測(cè)定研究［J］. 食品科學(xué)，2009，30(6):146-150.