顧小燕，唐鵬鵬，李寧波，劉歡，俞靜，何鳳云

(南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，南京 211171)

鹽酸吡哆辛(Pyridoxine hydrochloride，VB6)是一種動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在的輔酶類B族維生素。VB6在氨基酸的合成和分解過(guò)程有著重要作用，在人體內(nèi)代謝成磷酸吡哆醛并參與多種代謝反應(yīng)，人體過(guò)少或過(guò)多攝入VB6都會(huì)對(duì)人體造成不良影響，因此建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的VB6含量測(cè)定方法具有重要意義。

目前對(duì)VB6的檢測(cè)方法有高效液相色譜法［1］，熒光法［2］、紫外分光光度法［3］、氯酸非水滴定法［4］、毛細(xì)管電泳法［5］等。與這些傳統(tǒng)方法相比，電化學(xué)法具有操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定，而VB6具有電化學(xué)活性，可用電化學(xué)方法直接測(cè)定［6］。目前測(cè)定VB6的電化學(xué)方法中，多采用化學(xué)修飾電極，修飾材料包括三聯(lián)吡啶釕修飾硼摻雜氧化金剛石電極［7］、電化學(xué)物質(zhì)摻雜的聚(3，4)-乙烯二氧噻吩膜修飾電極［8］、聚苯胺藍(lán)／多壁碳納米管［9］、聚氨基黑10B［10］、聚L-色氨酸修飾［11］、聚硫堇／亞鐵氰根修飾碳糊電極［12］和納米金／石墨烯電極［13］等。

煙酸(3-吡啶甲酸)具有重要的生理作用，目前已有研究其電化學(xué)行為的報(bào)道［14–15］，但是利用其作為電極修飾材料則鮮有報(bào)道［16–17］。筆者用煙酸作為聚合材料，制備的聚煙酸膜修飾電極對(duì)VB6的檢測(cè)具有良好的增敏作用，并可顯著提高電極的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)探討了支持電解質(zhì)種類、支持電解質(zhì)溶液pH、掃描速度等參數(shù)對(duì)測(cè)定鹽酸吡哆辛的影響，優(yōu)化了測(cè)試條件，建立了快速測(cè)定鹽酸吡哆辛的電化學(xué)方法，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電化學(xué)工作站：CHI660C型，上海辰華儀器公司；

精密pH計(jì)：pH–3C型，上海雷磁儀器廠；

超聲波清洗器：KQ2200型，昆山市超聲儀器有限公司；

維生素B6片：南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司；

煙酸：化學(xué)純，上?；瘜W(xué)試劑公司；

鹽酸吡哆辛：生化試劑，中國(guó)慧興生化試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 修飾電極的制備

將玻碳電極在金相砂紙上打磨，用0.05 μm的氧化鋁粉末拋光成鏡面后，去離子水沖洗后依次放入硝酸(體積比為1∶1)、乙醇、水中超聲1 min，自然風(fēng)干后待用。將活化后的玻碳電極(GCE)置于含有0.02 mol／L煙酸(NA)的pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，在–1.8～2.4 V范圍內(nèi)以0.1 V／s掃描速度電聚合10圈，取出后用水淋洗，自然風(fēng)干即制得聚煙酸修飾玻碳電極(PNA／GCE)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取適量的鹽酸吡哆辛標(biāo)準(zhǔn)溶液或者樣品待測(cè)液置于電解池中，采用三電極體系進(jìn)行測(cè)量，以GCE或者PNA／GCE為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極(本實(shí)驗(yàn)所述電位均是相對(duì)此電極而言)，鉑片電極為對(duì)電極，進(jìn)行循環(huán)伏安法(CV)或差分脈沖伏安法(DPV)掃描。

把制備好的修飾電極放在pH 3.6的HAc–NaAc緩沖溶液中靜置2 s后，以100 mV／s的掃描速度掃描200圈，可以充分減小充電電流。每次在測(cè)試結(jié)束后將電極放入空白底液中多次掃描直至無(wú)明顯氧化峰出現(xiàn)，即可將吸附在電極表面的殘余VB6除去，恢復(fù)電極活性。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(25±1)℃下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 PNA／GCE的電化學(xué)行為

聚煙酸(PNA)在GCE上的循環(huán)伏安圖如圖1所示。當(dāng)掃描第一圈時(shí)，分別在–0.3，0.4，1.5 V處出現(xiàn)一個(gè)還原峰和兩個(gè)氧化峰，隨著掃描圈數(shù)的增加，峰電流隨之增加，說(shuō)明聚煙酸膜的厚度在不斷增加。當(dāng)掃描圈數(shù)達(dá)到10圈時(shí)，峰電流趨于穩(wěn)定，同時(shí)肉眼可觀察到電極表面有一層有光澤的藍(lán)綠色膜生成，說(shuō)明此時(shí)聚煙酸修飾膜已經(jīng)通過(guò)電聚合方法生成。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，新制備的修飾電極在空白底液中反復(fù)掃描可大大減小充電電流、改善峰形，這可能是在酸性條件下聚合物分子在GCE在基底上存在重新排列或重新聚合的過(guò)程，從而使聚合膜更有利于VB6的電子轉(zhuǎn)移。

圖1 煙酸聚合過(guò)程循環(huán)伏安曲線

2.2 VB6在PNA／GCE上的電化學(xué)響應(yīng)

如圖2所示，VB6在裸電極與聚煙酸修飾電極上均只出現(xiàn)了氧化峰而無(wú)對(duì)應(yīng)的還原峰，說(shuō)明VB6在電極上為完全不可逆氧化過(guò)程。在裸玻碳電極上(曲線a)出現(xiàn)一個(gè)寬而弱的氧化峰(Ipa=6.33 μA)，在PNA／GCE(曲線b)上峰形變好，峰電流增大為原來(lái)的2.70倍(Ipa=17.82 μA)，說(shuō)明煙酸對(duì)VB6的測(cè)定具有明顯的增敏作用。

圖2 0.2 mmol／L鹽酸吡哆辛在不同電極上的循環(huán)伏安圖

2.3 測(cè)試條件的優(yōu)化

2.3.1 聚合圈數(shù)的影響

在濃度為0.2 mmol／L的VB6溶液中，以不同圈數(shù)對(duì)聚煙酸電極進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚合煙酸時(shí)隨著掃描圈數(shù)的增加，電極聚合煙酸測(cè)定的VB6特征峰逐漸變大，當(dāng)掃描圈數(shù)達(dá)到10圈時(shí)，峰電流最大且基本穩(wěn)定，聚合煙酸膜基本穩(wěn)定。當(dāng)掃描圈數(shù)大于10圈時(shí)峰電流開(kāi)始減小，可能是因?yàn)樾揎椖ず穸冗^(guò)大電阻增大，因此聚合煙酸的掃描圈數(shù)設(shè)定為10圈。

2.3.2 掃描速度的影響

考察了掃描速度對(duì)VB6氧化峰電流和電位的影響，見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，隨著掃描速度的增大，峰電位逐漸正移，峰電流增大，但隨著掃描速度增大，噪聲變大，綜合各方面的因素，選擇100 mV／s掃描速度進(jìn)行以下試驗(yàn)。數(shù)據(jù)經(jīng)擬合后(見(jiàn)圖4)發(fā)現(xiàn)，VB6氧化峰電流Ipa(μA)與掃描速度的平方根v1／2(mV／s)呈 良 好 的 線 性 關(guān) 系，線 性 方 程 為Ipa=1.84v1／2–1.91(r2=0.991 5)，這說(shuō)明VB6在電極上的氧化過(guò)程受擴(kuò)散控制。VB6氧化峰電位Epa(V)與lnv(mV／s)呈線性關(guān)系(見(jiàn)圖5)，線性方程為Epa=0.025 3lnv+0.992 6(r2=0.992 5)，該方程可用于計(jì)算氧化過(guò)程中的電子轉(zhuǎn)移數(shù)。

圖3 在不同掃描速度下VB6在PNA／GCE上的循環(huán)伏安圖

圖4 VB6的氧化峰電流與掃描速度的平方根的關(guān)系

圖5 VB6的氧化峰電位與lnv的關(guān)系

2.3.3 緩沖溶液pH對(duì)VB6的影響

以聚煙酸修飾電極為工作電極在100 mV／s的掃描速度下考察不同pH對(duì)VB6的峰電位與峰電流的影響。圖6為VB6在pH為2.9，3.0，3.1，3.4，3.6，4.0，4.4的不同緩沖溶液中的CV圖。從圖6可以看出，當(dāng)緩沖溶液pH值為3.6時(shí)，VB6氧化峰的電流值達(dá)到最大，所以選擇pH 3.6的緩沖溶液作為支持電解質(zhì)。隨著pH值的增大，氧化峰電位逐漸負(fù)移，說(shuō)明電極反應(yīng)過(guò)程有質(zhì)子參與。經(jīng)擬合后，VB6氧化峰電位和pH呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Epa(V)=–0.113 7pH+1.496 8 (r2=0.998 0)，可知VB6在PNA／GCE上反應(yīng)過(guò)程中涉及的質(zhì)子數(shù)電子數(shù)之比是2。

圖6 VB6在不同pH的緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖

2.4 VB6在PNA／GCE上的氧化過(guò)程

對(duì)于不可逆的電極反應(yīng)過(guò)程，峰電位根據(jù)Bulter–Volmer公式［11］(1)計(jì)算：

式中：Ep——峰電位，V；

Eθ——標(biāo)準(zhǔn)電位，V；

α——電子轉(zhuǎn)移系數(shù)(對(duì)于不可逆反應(yīng)，α常在0.4～0.6之間取值)；

n——電子轉(zhuǎn)移數(shù)；

F——法拉第常數(shù)，96 487 C／mol；

R——?dú)怏w常數(shù)，J／(K·mol)；

T——溫度，K；

kθ——標(biāo)準(zhǔn)速率常數(shù)；

v——掃描速度，mV／s。

由圖5擬合峰電位(V)與掃描速度(mV／s)的數(shù)據(jù)，可以得到方程(r2=0.992 5)見(jiàn)式(2)：

由式(1)可得αn=0.51，此時(shí)α取0.5，則計(jì)算求得n=1.0，即轉(zhuǎn)移電子數(shù)n=1，再根據(jù)2.3討論得到的結(jié)論：VB6在PNA／GCE上反應(yīng)過(guò)程中涉及的質(zhì)子數(shù)與電子數(shù)之比為2，則VB6在該復(fù)合修飾膜上的電極反應(yīng)是兩質(zhì)子一電子參與的電極過(guò)程。

文獻(xiàn)［6］報(bào)道鹽酸吡哆辛在電極上有著復(fù)雜的變化過(guò)程，第一次掃描時(shí)在Epa=0.81 V有一個(gè)明顯的氧化峰。在酸性條件下，該處的氧化峰對(duì)應(yīng)吡哆醇結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成吡哆醛結(jié)構(gòu)，與本實(shí)驗(yàn)所觀察到的氧化峰基本一致。

2.5 線性方程、線性范圍與檢出限

為進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，采用差分脈沖伏安法測(cè)定VB6的含量，在pH 3.60的緩沖溶液中，電位增量0.01 V，振幅0.05 V，脈沖寬度0.2 s，脈沖周期0.5 s，靜置時(shí)間2 s條件下，不同濃度VB6在PNA／GCE上的差分脈沖伏安圖見(jiàn)圖7。在0.08～40 μmol／L和40～400 μmol／L范圍內(nèi)，VB6的氧化峰電流Ipa(μA)與濃度c(μmol／L)呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為：Ipa=0.167 2c+0.219 6 (r2=0.995 3)和Ipa=0.012 5c+6.501 2(r2=0.993 2)，方法檢出限(S／N=3)為0.02 μmol／L。與已報(bào)道的測(cè)定VB6的電化學(xué)方法［6–12］相比，本法檢出限更低，與納米金／石墨烯修飾電極［13］檢出限相同，但是本法線性范圍寬，制備方便，能滿足對(duì)樣品的實(shí)際測(cè)定。

圖7 不同濃度VB6在PNA／GCE上的差分脈沖伏安圖

2.6 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在最優(yōu)條件下，采用循環(huán)伏安法用同一根修飾電極對(duì)0.2 mmol／L的VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定8次，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%，說(shuō)明該方法具有良好的精密度。用相同的修飾方法修飾5支電極，測(cè)定同一份0.2 mmol／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.6%，說(shuō)明該電極具有良好的重現(xiàn)性。將修飾電極避光浸入空白底液放入4℃的冰箱內(nèi)保存5 d后再次進(jìn)行測(cè)定，電流衰減約15%，由此可見(jiàn)本法修飾電極具有良好的穩(wěn)定性，克服了化學(xué)修飾電極重現(xiàn)性差、不能重復(fù)使用的缺點(diǎn)。

表1 同一根修飾電極對(duì)0.2 mmol/L的VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定結(jié)果

表2 5根電極測(cè)定同一份0.2 mmol/L的VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果

2.7 干擾試驗(yàn)

在優(yōu)化條件下，用聚煙酸修飾電極測(cè)對(duì)濃度為0.2 mmol／L的鹽酸吡哆辛進(jìn)行干擾測(cè)試。試驗(yàn)結(jié)果表明，誤差在±5%之內(nèi)時(shí)，200倍的K+，Na+，Cl-，NO3–；50倍的SO42–，Ag+，Al3+，Ca2+均不產(chǎn)生干擾；25倍的抗壞血酸和10倍的酪氨酸對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾。

2.8 樣品測(cè)定及回收試驗(yàn)

取市售維生素B6片少量，研磨成粉末后用二次水溶解，充分振蕩，取上層清液，按照說(shuō)明書所述，每片含10 mg VB6，稀釋到所需濃度，用本方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，回收率為95.8%～103.7%，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

表3 維生素B6片中VB6含量的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

研究了VB6在聚煙酸修飾電極上的電化學(xué)行為，該修飾電極能夠明顯提高VB6的氧化電流，檢出限低至0.02 μmol／L，且該電極穩(wěn)定性好，制備簡(jiǎn)單，實(shí)用性好，可實(shí)現(xiàn)藥物中VB6的快速靈敏檢測(cè)，為VB6的質(zhì)量控制提供了一種新的方法。

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