影響富油微藻高密度培養(yǎng)及產(chǎn)油因素研究進(jìn)展*

張森，華美云，楊渝杰，劉平懷

(海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點實驗室，海南?？?，570228)

微藻是一類微小藻類的統(tǒng)稱，既有原核種類(如藍(lán)藻)，亦有真核種類(如綠藻)，大部分為單細(xì)胞或簡單多細(xì)胞，均能進(jìn)行光合作用，是地球上最古老的初級生產(chǎn)者之一［1］。其形態(tài)多樣，適應(yīng)性強，分布廣泛，應(yīng)用極廣，如用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水處理，可提取或加工成醫(yī)藥保健品及化妝品，也可作為制備生物氫氣及生物柴油等生物能源的原料。

特別是目前，使用微藻制備生物柴油成為新一輪“微藻熱”的主要原因。和陸生油料植物等生物柴油原料相比，微藻生長快、油脂含量高、單位面積的年產(chǎn)量高;可以使用海水、污水或工業(yè)廢氣培養(yǎng)，既節(jié)約了土地和淡水資源，又綠色、清潔和環(huán)保;還可避免地溝油、動物脂肪等來源多樣、品質(zhì)不穩(wěn)、產(chǎn)量有限等缺點，可實現(xiàn)全年連續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)，質(zhì)量容易控制。盡管微藻具有上述眾多優(yōu)良特性，但大規(guī)模培養(yǎng)微藻制備生物柴油尚需解決優(yōu)良藻種的選育、高密度培養(yǎng)技術(shù)、微藻采收、脫水和高效生物反應(yīng)器設(shè)計等技術(shù)問題。本文從藻種、營養(yǎng)因素、培養(yǎng)條件、營養(yǎng)方式及培養(yǎng)方式等方面，闡述微藻高密度培養(yǎng)中影響微藻生長及油脂積累因素的最新研究進(jìn)展，以期為微藻生物柴油及微藻培養(yǎng)研究在高產(chǎn)油微藻培養(yǎng)技術(shù)方面提供參考。

1 藻種

由于微藻的多樣性，不同藻種或藻株間的生長狀態(tài)及油脂含量相差很大。富油微藻的油脂含量可達(dá)其干重的30%－50%，特殊條件下有些甚至可以達(dá)到80%。美國水生物種項目(ASP)篩選的優(yōu)勢藻種中，多為硅藻綱(Bacillariophyceae)和綠藻綱(Chlorophyceae)藻類。微藻并不都具有生產(chǎn)油脂的潛力。而且通常油脂含量高的藻生長緩慢、生物量較低，而生長較快、生物量較高的微藻其油脂含量又較低，所以綜合考慮生長速率、生物量、油脂含量、適應(yīng)性及抗逆性等方面，選擇合適的藻種(株)對提升產(chǎn)油量、油脂品質(zhì)和連續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)十分關(guān)鍵(表1為部分具有油脂生產(chǎn)潛力的微株及產(chǎn)油情況)。

表1 部分具有油脂生產(chǎn)潛力的微藻藻株及產(chǎn)油情況Table 1 Lipids contents and yields of several oleaginous microalgae strains

2 營養(yǎng)元素

營養(yǎng)元素的種類、比例以及濃度水平對微藻的生長、生物量、生物化學(xué)成分和代謝產(chǎn)物，甚至是外觀形態(tài)都具有不可忽視的作用。微藻生長必須的元素一般包括 C、H、O、N、P、S、Si、K、Ca、Mg和 Fe等，此外還需要諸如 Cu、Co、Mo、B、Zn及維生素等一些微量元素。碳、氫和氧可以從水和空氣中獲得，其他營養(yǎng)元素需從營養(yǎng)鹽中得到［2］。

2.1 碳

CO2是微藻光合自養(yǎng)的主要碳源，一般，藻類可利用的CO2濃度為1% ～5%，有些耐高濃度CO2的藻類甚至可以達(dá)到50%。通常空氣中的CO2通過攪動或鼓氣進(jìn)入培養(yǎng)基而被藻類吸收，適量增加CO2濃度能夠明顯促進(jìn)藻類的生長、增加生物量和油脂產(chǎn)率。Nannochloropsis sp．PP983在CO2濃度為0.28%時油脂含量比0.038%時更高［3］。但是過高的CO2濃度會使培養(yǎng)基的pH值降低，進(jìn)而進(jìn)一步影響胞外對CO2固定具有重要作用的碳酸酐脫水酶的活性以及其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，最后限制微藻的生長。Nannochloropsisoculata NCTU－3在2%的CO2濃度下具有最高的生物量和油脂產(chǎn)率，超過此濃度則生物量和油脂產(chǎn)率較低［4］。除CO2外，碳酸鹽和碳酸氫鹽也常作為微藻自養(yǎng)培養(yǎng)時的碳源，和 CO32－相比HCO3－更容易被利用，而且適當(dāng)添加HCO3－能促進(jìn)微藻的光合作用速率，但濃度過高會由于pH值的增高而使藻類生長、生物量和油脂產(chǎn)量降低。

添加適量無機碳能促進(jìn)藻類生長和光合作用的主要機制可能為:通過HCO3－的主動轉(zhuǎn)運和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase)調(diào)控HCO3－和CO2的相互轉(zhuǎn)化，使核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶周圍的CO2濃度升高，一方面增加CO2對核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶結(jié)合位點的競爭，提高羧化速度;另一方面抑制光呼吸作用，提高凈光合效率［13］。但是要想提高藻類利用CO2的效率以及在更高CO2濃度中的生長和油脂積累，其調(diào)控過程及高濃度CO2損傷作用的機理還需進(jìn)一步深入研究［5］。

2.2 氮

氮元素是承擔(dān)微藻生長、光合作用及繁殖等生命活動過程中所涉及的蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)合成的必須元素。可供藻類利用的氮源主要有氨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮，藻類在利用這些氮源的程度上一般存在很大差別，通常為銨態(tài)氮 ＞硝態(tài)氮 ＞亞硝態(tài)氮［6］。無機銨態(tài)氮可以直接通過轉(zhuǎn)氨作用合成氨基酸等，但是脫氨后會使培養(yǎng)液pH大幅下降從而使生物量和油脂產(chǎn)量降低。相比之下有機氨氮的尿素、硝態(tài)氮的硝酸鈉和硝酸鉀使用最為廣泛，對微藻生長和油脂積累也最為有效。Neochlorisoleoabundans UTEX1185在以硝酸鈉、尿素及氯化銨為氮源時，在硝酸鈉中的生長最佳，生物量、油脂含量及產(chǎn)量也最高。和硝酸鈣、氯化銨、硝酸銨相比，Scenedesmusbijugatus在硝酸鈉、硝酸鉀及尿素中的生長更好，生物量更高［7］。氮濃度對微藻的生長和油脂積累有更顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn)，低氮或缺氮能明顯誘導(dǎo)微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累。如Chlorella zofingiens在全氮培養(yǎng)基中的油脂含量為33.5%，而在缺氮培養(yǎng)下的油脂含量為65.1%［8］。Margret Piorrec發(fā)現(xiàn)綠藻(Chlorellavulgaris和Scenedesmusobliquus)在低氮水平下的油脂含量為45%，而在高氮水平下油脂含量降到大約20%［9］。雖然缺氮或低氮可以使微藻細(xì)胞內(nèi)大量積累油脂，但是也會導(dǎo)致微藻生長差，生物量降低。Chlorella sp.在氮濃度為0.09 mmoL/L時的生物量幾乎是氮濃度為0.418 mmoL/L 的一半［10］。Hsieh 等［7］發(fā)現(xiàn) Chlorella sp.在高尿素濃度(0.200 g/L)時的比生長速率和生物量分別是低氮(0.025 g/L尿素)條件下的5倍和2倍。

低氮有助于微藻細(xì)胞油脂積累已成為目前提高微藻油脂產(chǎn)量的一種常用方法。為解決微藻高生物量，低油脂含量或高油脂含量，低生物量的矛盾，研究者利用微藻在高氮條件下積累生物量而在低氮或缺氮條件下積累油脂的特點，采用兩步培養(yǎng)法取得了很好的效果，即微藻先于富氮培養(yǎng)基中積累生物量，一定時期后再轉(zhuǎn)移至低氮或缺氮培養(yǎng)條件下積累油脂。Chlorella vulgaris UTEX 259，Chlorella zofingiensis UTEX B32和Scenedesmusobliquus UTEX 393采用兩部培養(yǎng)法培養(yǎng)時，在第二步缺氮培養(yǎng)中生物量沒有降低，反而增加了2～4倍，而油脂含量比第一步富氮培養(yǎng)時增加了2～3倍，極大地提高了油脂產(chǎn)量［11］。雖然缺氮可以明顯促進(jìn)大部分微藻積累油脂，但其具體機理還不是很清楚，已有的研究表明，在外源氮含量缺乏或較低時，為使細(xì)胞維持足夠的氮攝入，藻細(xì)胞內(nèi)的腺苷一磷酸脫氨酶大量增加，將AMP中的氮轉(zhuǎn)化為氨，以補充細(xì)胞內(nèi)氮元素缺乏，同時線粒體中的異檸檬酸脫氫酶多為AMP依賴性酶，胞內(nèi)AMP濃度的降低將會抑制或減弱該酶的活性，而該酶活性的降低會使三羧酸循環(huán)中的檸檬酸大量積累，并被檸檬酸裂解酶催化生成乙酰輔酶A，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)油脂合成的增加［13］。

2.3 磷

磷是微藻生長過程中非常重要的元素之一，參與核酸、ATP、磷脂及輔酶等合成，同時還可以以聚偏磷酸鹽的形式在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行儲存［12］，所以磷在細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)控細(xì)胞生長和代謝的作用，如能量轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，大分子生物合成，光合作用和呼吸作用等。通常的磷源有磷酸氫鹽和磷酸鹽，其中正磷酸鹽較易被吸收，且對生長促進(jìn)作用顯著［13］。和氮源相似，研究發(fā)現(xiàn)許多微藻在磷限制的條件下也可以大量積累油脂，如 Phaeodactylumtricornutum，Chaetoceros sp.，Pavlovalutheri，Chlorella sp.，Scenedesmus sp.LX1，Chlorella zofingiensis和Rhodosporidiumtoruloides等在低磷或缺磷條件下油脂含量極大地提高，然而部分微藻在此種條件下油脂含量會減少，如Nannochlorisatomus和Tetraselmis sp.等［14］。通常過低或過高的磷濃度都會使微藻生長較差，生物量降低。磷限制導(dǎo)致微藻細(xì)胞內(nèi)積累油脂的具體機理還不是很清楚，部分研究表明磷限制和氮限制中的機理可能相似，缺磷可能會導(dǎo)致AMP分解出無機磷以供維持細(xì)胞基本生命活動，而AMP的大量減少會引起的一系列生理生化途徑改變，進(jìn)而促進(jìn)油脂積累。還有研究發(fā)現(xiàn)在低磷高碳條件下，一方面油脂合成途徑中的關(guān)鍵酶——乙酰輔酶A羧化酶的活性增強，另一方面過量的碳進(jìn)入三羧酸循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致三酰甘油的合成。

2.4 鐵

鐵是浮游植物生長必須的礦物質(zhì)元素，參與生長過程中的電子傳遞、氧的新陳代謝、氮的吸收利用、葉綠素的光合作用及呼吸作用等生命活動。所以鐵濃度對微藻生長、生物量及油脂含量均具有非常顯著的影響。較高濃度的鐵對中肋骨條藻和旋鏈角毛藻的光合作用和生長具有明顯的促進(jìn)作用［15］。Chlorella vulgaris在生長末期添加FeCl3可以增加細(xì)胞密度，隨鐵離子濃度的上升(0～1.2×10－5mmoL/L)，油脂含量從7.8%增加到了56.6%［16］。劉志媛發(fā)現(xiàn)高鐵濃度對Chlorella vulgaris的油脂積累具有明顯的促進(jìn)作用［17］。Chittra等對4株葡萄藻的研究也表明較高的鐵濃度有助于葡萄藻油脂的積累，但鐵濃度達(dá)到一定濃度后，油脂的積累沒有明顯差異［18］。

2.5 硅

硅是硅藻生長必須的營養(yǎng)元素，其除了構(gòu)成硅藻細(xì)胞壁外，還廣泛參與DNA、光合色素、蛋白質(zhì)等的合成和細(xì)胞分裂等多種生化代謝和生長過程。如同氮磷限制，硅限制會導(dǎo)致硅藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成增加。培養(yǎng)基中的Na2SiO3·H2O從200 mg/L降到0，纖細(xì)角毛藻的油脂含量由13.25%升高到37.14%［19］。

2.6 維生素和植物生長激素

維生素雖然不是微藻生長必須的營養(yǎng)因子，但其是部分微藻細(xì)胞增殖的必須因子，可以提高有關(guān)合成酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)微藻生長并對脂肪酸的組成產(chǎn)生影響。常用的維生素有硫胺素(B1)、鈷胺素(B12)及生物素(H)等，不同的維生素或其混合物對微藻特別是海洋微藻的生長具有明顯的影響。如B1對海洋小球藻的生長具有極顯著的促進(jìn)作用，而其他兩種維生素沒有明顯影響［20］。胡桂坤等發(fā)現(xiàn)除了生物素外，B1和B12均對赤潮異彎藻增殖具有顯著促進(jìn)作用且存在交互作用［21］。所以在微藻培養(yǎng)中常需添加多種維生素。

植物生長激素和維生素一樣，雖不是必須營養(yǎng)因子，但適量添加不同的植物生長激素對微藻的生長、增殖和生化成分有一定的影響。如適量添加IAA可以促進(jìn)Nannochloropsisoculata CS-179細(xì)胞生長，縮短生長周期，但濃度較高時促進(jìn)生長作用較小，且抑制葉綠素和不飽和脂肪酸合成［22］。2，4-D對Chlorella protothecoides的生長具有明顯的促進(jìn)作用，而且油脂含量比空白對照高26.21%。

維生素和植物生長激素普遍對微藻具有促進(jìn)生長及增殖的作用，但對微藻生化組成特別是油脂積累方面的研究較少。所以，其對微藻油脂的積累值得進(jìn)一步深入研究。

2.7 其他

除上述元素外，培養(yǎng)基中的 Mg、Ca、Mn、Mo、Cu、Zn及B等所需量較低，但對微藻生長和生理生化具有不可忽視的影響。Ankush等發(fā)現(xiàn)較高的Mg濃度不利于 Chlorococcuminfudionum 生物量的積累［23］。Cheng等對Chlorella protothecoides UTEX 250的研究也發(fā)現(xiàn)，和添加鎂的培養(yǎng)基相比，移除Mg的培養(yǎng)基對小球藻生物量和油脂積累具有積極影響［24］。鎂、銅及鈣對Chlorella sorokiniana CS-01的生長和脂質(zhì)積累具有一定的促進(jìn)作用。Scenedesmusobliquus DHD－3在過高或高低的Mn濃度下不利于其生長和油脂的積累，在濃度為2.72 mg/L時，油脂含量比對照組提高了 11%［25］。

3 培養(yǎng)條件

微藻培養(yǎng)過程中，除了培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對微藻生長和生理生化至關(guān)重要外，諸如溫度、光照、pH、鹽度等培養(yǎng)條件對微藻細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物生產(chǎn)具有十分重要的調(diào)節(jié)和控制作用。

3.1 溫度

溫度可以調(diào)節(jié)微藻細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)速率，過低或過高的溫度會使藻細(xì)胞生長減緩或死亡。微藻生長均有最適生長溫度，一般為20～35℃。研究表明，溫度對微藻生長和油脂積累的影響因種而異，Nannochloropsisoculata H和Chlorella vulgaris CCAP 211最適生長溫度分別為25℃和20℃。最適生產(chǎn)油脂溫度均為25℃，而Scenedesmus sp.在20℃下最適積累生物量和油脂［26］。通常微藻生長和油脂積累的最適溫度并不一致，如Isochrysis sp.T.ISO和Rhodomonas sp.NT15在25℃時的生長密度最大，而在27℃下油脂含量最高;Prymnesiophyte sp.NT19和 Cryptomonas sp.CRFI01正好相反［27］?；跍囟葘ξ⒃逭{(diào)控的這一特性，有研究采用兩步溫度控制法來使微藻生長和油脂積累達(dá)到最大，如Thalassiosirapseudonana CCAP 1085/12，Odontellaaurita CCAP 1054/1 和 Dunaliellatertiolecta CCAP 19/27在20℃下生長并積累生物量，然后再在10℃下積累油脂，第二步中的油脂積含量是第一步油脂含量的數(shù)倍，比基于營養(yǎng)元素的兩步控制法容易操作。溫度對微藻油脂積累的調(diào)控作用可能和溫度對微藻氮、磷等吸收利用的影響間接相關(guān)。

3.2 光照

光照是制約微藻光合作用和生長最重要的因子，可從3個方面對微藻生長和油脂積累產(chǎn)生影響，即光照強度、光質(zhì)及光照周期。光照強度在微藻光合作用光補償點以上才會有生物量的積累，而當(dāng)光強超過光飽和點后，光強再增高，光合效率也不會再提升，而且光強過高反而還會產(chǎn)生光抑制。因此在培養(yǎng)過程中需采用適當(dāng)?shù)墓庹諒姸?，并盡量接近光飽和點，以使微藻處于最大光合效率的狀態(tài)［13］。光質(zhì)指光照波長，像植物光合作用一樣，微藻的光合作用對光波長的吸收具有選擇性，通常為紅光和藍(lán)光。研究表明，Scenedesmus sp.LX1在以紅光、藍(lán)光及紅藍(lán)光為光源時比白光下的生長速率更高，紅藍(lán)光下Scenedesmus sp.LX1生長最快，生物量最高，但油脂含量最低，而白光下的油脂含量最高［28］。此外紅藍(lán)光的比例會影響Scenedesmus sp.LX1對氮磷的吸收和利用［29］。所以光照波長的選擇不僅對微藻生長具有影響，對其油脂的積累以及營養(yǎng)元素的利用也存在很大的影響。光照周期，即光暗比，對微藻生長、油脂積累和油脂成分也具有顯著的影響，如Nannochloropsis sp.在光暗比為18 h∶6 h時，生長速率和油脂含量最高，而在半光照或全光照條件下均較低。Chlorella vulgaris在16 h∶8 h的光照下飽和脂肪酸含量最高，隨著光暗比增加單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量減少。除了光暗時間比之外，光暗交替頻率，即藻細(xì)胞在光區(qū)與暗區(qū)交替達(dá)到一定頻率時，會產(chǎn)生類似“閃光效應(yīng)”，有助于提高微藻對光的利用率［30］。

3.3 pH

pH是微藻培養(yǎng)過程中不可忽視的培養(yǎng)參數(shù)之一，不僅可以影響藻細(xì)胞的帶電荷狀態(tài)，還可以影響培養(yǎng)基中電解質(zhì)的解離和溶解形式，進(jìn)而影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的利用、細(xì)胞的沉降或死亡。pH在5以下時，無機碳源基本以CO2形式存在，pH為6.6時，CO2與HCO3－大體持平，pH為8.3時，無機碳主要以HCO3－形式存在［31］，所以無機碳的利用和培養(yǎng)基pH具有非常緊密的關(guān)系。不同藻種對酸堿度的耐受性不一樣，一般為5～11，耐堿程度越大，對微藻在培養(yǎng)過程中免受其他微生物污染越有益。大量研究表明，pH的控制對微藻生長、生物量和油脂積累具有十分顯著的調(diào)控作用。Tetraselmissuecica CS-187可以在培養(yǎng)基pH為6.5～8中生長，但在pH為7.5時生物量和油脂產(chǎn)量最高，而Chlorella sp.在pH值7時生物量和油脂產(chǎn)量最高［32］。此外，高 pH可以誘導(dǎo)Scenedesmus sp.WC-1和小球藻油脂的積累，而且在缺氮下，高pH誘導(dǎo)油脂積累的能力比高pH或缺氮單獨誘導(dǎo)積累油脂的能力更強［33］。所以，pH和微藻生長和油脂代謝具有十分重要的關(guān)系。

3.4 鹽度

通常根據(jù)水體鹽度的不同將微藻培養(yǎng)基劃分成4類，淡水、咸水、海水及高鹽度水。無論哪種水體，適應(yīng)其環(huán)境的微藻會產(chǎn)生一些代謝物以保護(hù)細(xì)胞不被鹽分破壞且維持與環(huán)境的滲透壓平衡［26］。所以，對鹽度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)可以促進(jìn)微藻生長或油脂積累。如Nannochloropsissalina 1776在鹽度為22 PSU時，生長最佳，生物量最高，在培養(yǎng)后期提高鹽度時，油脂含量明顯增高［34］。劉平懷等研究發(fā)現(xiàn)，在淡水微藻Micractiniumreisseri C67的培養(yǎng)基中添加適量海鹽可以促進(jìn)其生長和油脂積累。有研究表明，部分綠藻在低鹽度下生長較好，而在較高鹽度下有利于生物量和油脂產(chǎn)量的提高。所以不論淡水藻還是海水藻，都可通過鹽度調(diào)節(jié)其生長和油脂生產(chǎn)狀態(tài)。

3.5 其他

除上述培養(yǎng)條件外，溶解氧、接種密度、通氣速率、攪拌速率及生物反應(yīng)器的類型等也是微藻培養(yǎng)過程中必須要考慮的主要問題，其對微藻生長、生物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)效率具有很大的影響。

微藻光合作用釋放大量O2，因此培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液里會累積大量的溶氧，若這些O2不及時排放可能會對微藻的生長甚至生存形成嚴(yán)重的脅迫，因此在培養(yǎng)中要采用攪拌或循環(huán)流動等方式排放溶氧。朱俊英等認(rèn)為溶氧對微藻的影響可能主要有兩方面:一為可能會氧化碳同化過程中一種或數(shù)種酶及電子傳遞鏈供體受體，從而對微藻形成脅迫;二為過高的溶氧可能會促使光合反應(yīng)朝逆向進(jìn)行，從而對光合作用產(chǎn)生抑制作用［13］。

通氣速率過大容易使培養(yǎng)液蒸發(fā)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度改變，進(jìn)而間接影響微藻生長，還會使培養(yǎng)液產(chǎn)生大量氣泡或?qū)⒃寮?xì)胞吹濺到培養(yǎng)容器壁上，進(jìn)而導(dǎo)致藻體死亡或染菌。

生物反應(yīng)器的類型不同極大地影響微藻培養(yǎng)方式和綜合培養(yǎng)條件，如跑道池是開放式培養(yǎng)，光生物反應(yīng)罐是密閉式培養(yǎng)，兩種不同的反應(yīng)器會導(dǎo)致不同培養(yǎng)方式，進(jìn)而制約了培養(yǎng)過程中的一系列培養(yǎng)條件。如薄板生物反應(yīng)器的光徑比通常的管式或柱式反應(yīng)器小，因而光合效率更高。各種不同的生物反應(yīng)器各有優(yōu)缺點，對不同的藻種、培養(yǎng)特征或生產(chǎn)要求，選擇適當(dāng)?shù)纳锓磻?yīng)器，既能節(jié)省成本，又能使微藻培養(yǎng)效益更高。

4 營養(yǎng)方式

微藻主要有4種營養(yǎng)方式，光合自養(yǎng)、異養(yǎng)、混(兼)養(yǎng)及光異養(yǎng)。營養(yǎng)方式不同，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用及代謝途徑也不盡相同，最終對微藻的生長，生化組成及代謝產(chǎn)物生產(chǎn)產(chǎn)生影響。

微藻均可進(jìn)行光合自養(yǎng)，自養(yǎng)培養(yǎng)具有可開放培養(yǎng)，培養(yǎng)成本低，不易染菌等，是目前大規(guī)模微藻培養(yǎng)中采用的主要營養(yǎng)方式，但是通常培養(yǎng)密度小且嚴(yán)重受制于光照。異養(yǎng)或混養(yǎng)比自養(yǎng)易高密度培養(yǎng)，油脂產(chǎn)率高，對光照制約較小，如Chlorella protothecoides在異養(yǎng)下的油脂含量是自養(yǎng)下的4倍［4］，Monoraphidium sp.C29在5g/L葡萄糖混養(yǎng)下的生物量和油脂產(chǎn)量分別是自養(yǎng)時的5.6倍和8倍［35］。但是異養(yǎng)或兼養(yǎng)方式的設(shè)備及培養(yǎng)操作成本較高［36］，而且會產(chǎn)生大量CO2，有違當(dāng)今的節(jié)能減排觀念。盡管有研究將自養(yǎng)與異養(yǎng)聯(lián)合起來，使異養(yǎng)產(chǎn)生的CO2在自養(yǎng)階段又重新被固定，可以大大節(jié)省碳源的使用，但是仍有諸如雜菌污染等許多關(guān)鍵技術(shù)問題需要解決。相比前3種營養(yǎng)方式，光異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的研究較少，不過已有的研究表明部分微藻在此種營養(yǎng)方式下可獲得比自養(yǎng)高出多倍的生長密度。Tetraselmissuecica利用馬鈴薯可溶物進(jìn)行光異養(yǎng)時的細(xì)胞培養(yǎng)密度是自養(yǎng)時的3.9倍［37］。實際上并不是所有的微藻均適宜或可直接進(jìn)行異養(yǎng)、混養(yǎng)或光異養(yǎng)培養(yǎng)，需經(jīng)藻種篩選或營養(yǎng)方式馴化培養(yǎng)。

總之，各營養(yǎng)方式均有其優(yōu)缺點，營養(yǎng)方式的選擇需綜合考慮藻種特性、培養(yǎng)成本以及下游處理等方面，揚長避短以使微藻培養(yǎng)和油脂生產(chǎn)效益最大。

5 培養(yǎng)模式

微藻培養(yǎng)模式是一種使微藻保持最佳生長或產(chǎn)物生成或營養(yǎng)充分利用的一種培養(yǎng)工藝，是國內(nèi)外研究的熱點之一。目前微藻常用的培養(yǎng)模式主要有分批(批次)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、流加培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。不同培養(yǎng)模式的選擇，對微藻生物質(zhì)、代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、營養(yǎng)成分利用以及培養(yǎng)成本和效益具有很大的影響。Chlorella vulgaris采用流加培養(yǎng)(流加硝酸鈉)時，生物量比分批培養(yǎng)高0.355 g/L，而采用更新率為1/4的半連續(xù)培養(yǎng)時，生物質(zhì)產(chǎn)率是分批培養(yǎng)下的1.7倍［38］。Nitzschiaceaeclosterium 和 Clorella vulgaris在稀釋率為1/5的連續(xù)培養(yǎng)模式下，可使培養(yǎng)密度穩(wěn)定在較高水平下，極大提高了生物量產(chǎn)量［39］。Chlorella sp.和Nannochloropsis sp.在流加培養(yǎng)下(流加葡萄糖)，油脂含量比分批培養(yǎng)分別提高1.5倍和1.3倍，而油脂產(chǎn)率分別提高1.9倍和2.0倍［5］。Chlorella protothecoides在流加培養(yǎng)下的生物量和油脂產(chǎn)量分別為45.2 g/L和24.6 g/L，而在分批培養(yǎng)下分別只有 23.5 g/L 和 14.6 g/L［40］。

雖然通常采用流加、半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)比分批培養(yǎng)產(chǎn)量或產(chǎn)率高，但是每種培養(yǎng)模式各有其優(yōu)缺，如分批培養(yǎng)操作簡單，花費低，適于不同培養(yǎng)因素對微藻生長及生化組成影響規(guī)律及培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究，但是營養(yǎng)鹽的消耗容易限制培養(yǎng)密度。而流加培養(yǎng)可以解決某些營養(yǎng)鹽在較高濃度下的抑制和毒害作用，比分批培養(yǎng)可顯著提高培養(yǎng)密度和生物量，但是需要確定流加的物質(zhì)及其濃度，以及流加方式(恒速或變速流加)。半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)也能明顯提高微藻生長和生產(chǎn)效率，但是操作較繁瑣，成本較高，易感染雜菌等，而且在合適的更新率或稀釋率下才能達(dá)到最佳效果。所以在實際研究或生產(chǎn)中需根據(jù)藻株生長特性、培養(yǎng)目的，產(chǎn)物生成以及成本等方面考慮，選擇適合的培養(yǎng)模式以使培養(yǎng)和生產(chǎn)時間縮短、成本降低以及效率提高。

6 總結(jié)與展望

富油微藻的高密度培養(yǎng)是微藻油脂產(chǎn)業(yè)和微藻生物柴油工業(yè)化中的主要瓶頸之一，而影響富油微藻高密度培養(yǎng)和產(chǎn)油的因素非常多，主要包括藻種、培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件、營養(yǎng)方式及培養(yǎng)模式等。藻種的影響是決定性因素之一，藻種的生長、生理生化代謝、抗逆性、貼壁或沉淀特性等對微藻是否易于培養(yǎng)、營養(yǎng)喜好和組成、反應(yīng)器選擇、營養(yǎng)方式、培養(yǎng)模式的選擇以及下游處理過程具有緊密的聯(lián)系。營養(yǎng)成分很容易影響微藻生長及生化組成，對微藻生長，繁殖及代謝產(chǎn)物生產(chǎn)具有重要的調(diào)控作用。大量實踐證明很多微藻在營養(yǎng)缺乏或環(huán)境壓力下，細(xì)胞內(nèi)可以積累大量的油脂，但是通常營養(yǎng)缺乏會導(dǎo)致微藻生長變差，生物量降低等，為克服生長和油脂積累的矛盾，科學(xué)工作者充分利用營養(yǎng)物質(zhì)豐富時微藻大量繁殖并積累生物量，營養(yǎng)匱乏時大量積累油脂的特點，采用基于營養(yǎng)調(diào)控的兩步培養(yǎng)技術(shù)獲得較好的效果，不過該技術(shù)還不成熟。因為兩步培養(yǎng)法不易操作且通常即使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)充足時，大部分藻類的培養(yǎng)密度還是達(dá)不到工業(yè)要求。培養(yǎng)條件也是微藻培養(yǎng)過程中不可回避的主題之一，在最優(yōu)的生長條件和最優(yōu)的產(chǎn)物積累條件下，微藻的生長，生物量和油脂產(chǎn)量才能達(dá)到最佳狀態(tài)，積極探索微藻生長、產(chǎn)物生產(chǎn)和培養(yǎng)條件的關(guān)系，對微藻培養(yǎng)理論研究和生產(chǎn)實踐具有雙重意義。營養(yǎng)方式的選擇對微藻培養(yǎng)具有十分顯著的影響，目前主要以自養(yǎng)、混養(yǎng)或異養(yǎng)研究較多，各營養(yǎng)方式各有優(yōu)缺點，自養(yǎng)成本低，但是難以高密度培養(yǎng)，而混養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)密度較大，但是有機碳源的使用使成本陡然上升。盡管利用異養(yǎng)高密度培養(yǎng)而自養(yǎng)固定CO2的特點而產(chǎn)生的基于營養(yǎng)方式的兩部培養(yǎng)技術(shù)極大地提高了碳循環(huán)利用率和油脂產(chǎn)量，節(jié)省了成本，但是仍有許多技術(shù)問題需要解決。自養(yǎng)培養(yǎng)密度的提高和異養(yǎng)成本的降低是今后微藻培養(yǎng)營養(yǎng)方式上要研究的主要方向。規(guī)模培養(yǎng)對培養(yǎng)模式的選擇具有很重要的經(jīng)濟上和效益上的影響。不同的培養(yǎng)模式各有其優(yōu)缺點，在研究或?qū)嵺`過程中培養(yǎng)模式的選擇需依據(jù)藻種特性、培養(yǎng)目的和成本等方面進(jìn)行考慮。

總之，富油微藻高密度培養(yǎng)和產(chǎn)油的理論研究已初步經(jīng)獲得不少成果，而且也積累了大量的實踐經(jīng)驗，開發(fā)了一系列的技術(shù)和方法，但是還需一方面繼續(xù)對某些關(guān)鍵問題和技術(shù)進(jìn)行深入研究，另一方面需要整合各方面研究和經(jīng)驗，從而從總體上降低富油微藻的培養(yǎng)成本，縮短生產(chǎn)周期，為微藻油脂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供堅實的保障。

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