苦參組織培養(yǎng)及快繁體系研究初探

趙 暉，紀(jì) 瑛，李秀麗

（甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

苦參（Sorphoa flavescens var.flavescens）為豆科苦參屬的變種，從其根、莖、葉和種子中提取的苦參堿、苦參素被大量應(yīng)用到醫(yī)藥、保健等方面，提取苦參堿、苦參素后的殘?jiān)彩巧a(chǎn)有機(jī)肥的好原料［1～3］?？鄥⒅械目鄥A作為植物殺蟲劑殺蟲效果好，對(duì)人、畜無毒害，且不產(chǎn)生抗藥性，具有廣闊的發(fā)展前景。長(zhǎng)期以來，苦參生藥資源大多以采挖野生植物為主，超限量采挖造成野生資源日益枯竭。近年來，一些地區(qū)相繼開展了人工苦參栽培，但大部分以采集野生種子繁殖為主，且能采集的苦參種子量非常有限，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，加之苦參種子硬實(shí)率高達(dá)90%以上，種皮硬，發(fā)芽率低，種苗嚴(yán)重不足已成為制約苦參規(guī)范化、規(guī)?；耘嗟钠款i［4～6］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)苦參組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道較少，若將組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用到苦參種苗繁殖和生產(chǎn)中，不僅可保持優(yōu)良母株性狀，而且繁殖速度快，對(duì)實(shí)現(xiàn)苦參規(guī)?；耘啵岣弋a(chǎn)量和品質(zhì)十分有利［7～8］。我們進(jìn)行苦參組培快繁體系中外植體選擇、適宜培養(yǎng)基篩選、馴化移栽等關(guān)鍵性技術(shù)研究，以期為苦參組培工廠化育苗提供技術(shù)支撐，也為藥用植物資源的種質(zhì)離體保存提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

初代培養(yǎng)的外植體選用當(dāng)年收獲的苦參種子增殖培養(yǎng)的外植體選用初代培養(yǎng)獲得的生長(zhǎng)健壯的無菌苗莖尖或莖段，生根培養(yǎng)的外植體選用繼代培養(yǎng)獲得的生長(zhǎng)健壯的無菌苗莖尖或莖段，馴化移栽苗選用生根培養(yǎng)時(shí)獲得的生長(zhǎng)健壯的無菌苗。NAA、6-BA均為分析純，由上?；菔郎噭┯邢薰旧a(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 初代培養(yǎng) 選擇粒大、飽滿的苦參種子，先用98%濃硫酸浸泡40 min后，再用自來水沖洗3次進(jìn)行預(yù)處理，然后在無菌條件下采用乙醇與升汞聯(lián)合的3種處理方法進(jìn)行消毒，處理1為75%乙醇 3 s+0.1%升汞 5 min，處理 2為 75%乙醇8 s+0.1%升汞8 min，處理3為75%乙醇10 s+0.1%升汞10 min。消毒后的種子接種在MS培養(yǎng)基（基礎(chǔ)MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH 5.8）上，每處理接種60瓶，每瓶3～4粒。置于（25±2）℃、1 500～2 000 Lx（10 h/d）條件下培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)污染率，21 d后統(tǒng)計(jì)成苗率。

1.2.2 增殖培養(yǎng) 在無菌條件下，將無菌苗（株高約10 cm）切割為帶單芽的莖段，接種于增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽與叢生芽。增殖培養(yǎng)基共設(shè)9個(gè)處理，處理①為MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，處理②為MS+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，處理③為MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，處理④為MS+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，處理⑤為MS+0.3 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，處理⑥為MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，處理⑦為MS+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA，處理⑧為MS+0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA，處理⑨為MS+0.5 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA。每處理接種30瓶，每瓶接種2～3個(gè)單芽莖段，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，7、21 d后統(tǒng)計(jì)總芽數(shù)及增殖率。

1.2.3 生根培養(yǎng) 在無菌條件下，將無菌苗切割為帶2個(gè)芽的莖段，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基6個(gè)，編號(hào)分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，Ⅰ為MS+0.1 mg/L NAA，Ⅱ?yàn)镸S+0.3 mg/L NAA，Ⅲ為MS+0.5 mg/L NAA，Ⅳ為1/2 MS+0.1 mg/LNAA，Ⅴ為1/2 MS+0.3 mg/LNAA，Ⅵ為1/2MS+0.5 mg/L NAA。每處理接種30瓶，每瓶接3～4個(gè)莖段，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。接種后30 d統(tǒng)計(jì)生根率，生根數(shù)及根長(zhǎng)。

1.2.4 馴化與移栽 選擇根長(zhǎng)1～2 cm的無菌苗，在自然光照下馴化5 d后從培養(yǎng)瓶中取出，輕輕洗去根部的瓊脂，分別栽入蛭石與田園土按1∶1配制的混合基質(zhì)和純蛭石兩種基質(zhì)中，移栽前先將基質(zhì)滅菌后裝入營(yíng)養(yǎng)缽中鋪平壓實(shí)，澆透水，移栽時(shí)用竹簽在基質(zhì)表面打孔，將組培苗栽入并壓實(shí)。每缽栽1株，每處理30缽。初期保持環(huán)境溫度20～25℃，間隔4 h噴水1次，保持空氣相對(duì)濕度80%以上，5 d后逐漸降低溫度與濕度，轉(zhuǎn)入自然光下培養(yǎng)，并于移栽后5、10、15 d統(tǒng)計(jì)組培苗成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒處理對(duì)苦參種子初代培養(yǎng)成苗的影響

由表1可見，利用不同的消毒方法處理苦參種子后，初代培養(yǎng)時(shí)污染率均未超過10%，成苗率為30.0%～68.2%。其中以處理2的污染率相對(duì)較低，為6.6%，成苗率最高，為68.2%，污染率較處理3高1.6百分點(diǎn)，較處理1低3.4百分點(diǎn)；成苗率較處理3高38.2百分點(diǎn)，較處理1高32.1百分點(diǎn)。且處理2成苗率與處理1差異顯著，與處理3差異極顯著。

表1 不同消毒處理苦參種子初代培養(yǎng)的污染率與成苗率

表2 不同激素配比的苦參誘導(dǎo)芽的增殖率

2.2 激素配比對(duì)苦參誘導(dǎo)芽增殖的影響

由表2可見，在添加不同濃度的NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基中，苦參無菌苗誘導(dǎo)芽增殖率各不相同。其中，處理9（MS+0.5 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA）的培養(yǎng)基在接種7 d后和21 d后的芽增殖率均為最高，分別為38.1%和120.2%，分別較其它處理高5.2～34.5百分點(diǎn)和38.1～101.2百分點(diǎn)；其次是處理7（MS+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA），雖然在接種7 d后增殖率最低，但在接種21 d后的增殖率較高，達(dá)82.1%。且接種7 d后，處理9與處理6、處理2、處理4差異顯著，與其它處理差異極顯著；接種21 d后，處理9與處理7差異不顯著，與其它處理差異極顯著。綜合考慮可見，MS培養(yǎng)基中分別添加0.1、3.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA、3.0 mg/L 6-BA的芽增殖效果較好。

表3 不同移栽基質(zhì)中苦參組培苗的移栽成活率

2.3 培養(yǎng)基對(duì)苦參組培苗生根的影響

由圖1、2、3可見，在MS培養(yǎng)基中分別添加0.1、0.3、0.5 mg/L NAA培養(yǎng)30 d后，苦參組培苗的生根率和生根數(shù)均隨NAA濃度的升高而增加，在添加0.1 mg/LNAA的培養(yǎng)基中，根系生長(zhǎng)更快，平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)。在1/2 MS培養(yǎng)基中，分別添加0.1、0.3、0.5 mg/L NAA培養(yǎng)30 d后，苦參組培苗的生根率、生根數(shù)及根長(zhǎng)均以添加0.1 mg/L NAA時(shí)最高。表明含低濃度無機(jī)鹽與生長(zhǎng)素NAA的培養(yǎng)基更有利于苦參組培苗生根。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)苦參組培苗生根率的影響

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)苦參組培苗生根數(shù)的影響

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)苦參組培苗平均根長(zhǎng)的影響

2.4 基質(zhì)對(duì)苦參組培苗移栽成活率的影響

由表3可見，移栽后5、10、15 d，均以純蛭石為基質(zhì)的組培苗成活率最高，達(dá)80%以上。移栽后15 d，蛭石與田園土混合基質(zhì)中的組培苗成活率僅為56.67%。在營(yíng)養(yǎng)缽中培養(yǎng)20 d后，苦參苗平均株高8.39 cm，葉片數(shù)5片，平均根長(zhǎng)4.23 cm，帶土移栽至大田后成活率可達(dá)90%以上。

3 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，以苦參種子作為外植體，采用75%乙醇8 s+0.1%升汞8 min消毒后，污染率低，易獲得無菌材料。MS培養(yǎng)基中分別添加0.1、3.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA、3.0 mg/L 6-BA的增殖效果較好，增殖率最高達(dá)120.2%。在1/2 MS培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L的NAA，更利于苦參組培苗生根。根長(zhǎng)1.00～2.00 cm的無菌苗，在自然光下馴化培養(yǎng)5 d后移栽至蛭石基質(zhì)中，成活率較高，移栽后5～15 d的成活率達(dá)80%以上。

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