路海博 孫元元 湯海港 張?zhí)N薇

摘 要 蔗糖是植物中重要的代謝產(chǎn)物，它直接或間接參與多種生理生化反應，研究其含量的變化規(guī)律對提高植物生物學產(chǎn)量和增強植物抗逆性具有重要的指導意義。蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖代謝的關鍵酶之一，它催化蔗糖代謝中的限速反應，SPS基因在分子水平編碼調(diào)控SPS。研究SPS基因克隆與表達規(guī)律是從分子水平揭示蔗糖代謝的基礎。本文綜述了近年來SPS基因克隆和表達研究進展，并展望了SPS基因的研究前景和應用前景。

關鍵詞 蔗糖 ；蔗糖磷酸合成酶基因 ；克隆 ；表達

分類號 Q943.2

蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物[1]，是碳運輸?shù)闹饕问剑彩恰皫臁贝x的主要基質(zhì)，蔗糖轉(zhuǎn)移效率[2]直接決定植物生長快慢；蔗糖參與植物滲透調(diào)節(jié)，環(huán)境脅迫下植物會大量合成蔗糖，提高細胞液濃度，阻止細胞質(zhì)過度失水；蔗糖通過反饋作用調(diào)節(jié)一些酶的活性，也可作為信號因子誘導或阻礙某些基因的表達。與蔗糖代謝相關的酶[3-4]有蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase， SPS）、蔗糖合成酶（sucrose synthetase， SuSy）和轉(zhuǎn)化酶（invertase， INV）。在這3種蔗糖代謝酶中，SPS是最重要的限速酶，它直接調(diào)控植物中蔗糖和淀粉的合成與分配，是催化蔗糖合成的主要酶[5]。

植物體內(nèi)蔗糖的積累與SPS活性正相關。已有研究表明，蔗糖是甜高粱[6]莖稈中糖分積累的主要形式，約占總含糖量的85%。甜高粱莖稈蔗糖含量與葉SPS蛋白質(zhì)的表達相關系數(shù)為0.895，與莖稈SPS蛋白質(zhì)的表達相關系數(shù)為0.781。比較高梁和甜高粱，隨著高粱的生長發(fā)育，SPS-A在莖稈中的表達不斷增強，與蔗糖積累增加趨勢一致。在生長后期，甜高粱莖稈中SPS-A表達量明顯高于普通高粱，這可能就是甜高粱蔗糖豐富積累的關鍵，表明高粱莖稈蔗糖積累[7]與SPS-A在莖稈中的表達相關。

SPS蛋白水平研究相對成熟，結構、性質(zhì)、活性調(diào)控[8-9]都已有報道。SPS廣泛存在于植物光合組織和非光合組織中，是一種低豐度、可溶性、不穩(wěn)定蛋白，酶活最適pH值約為7.0，由分子量117～138 kD的亞基構成為二聚體或四聚體。SPS在植物體內(nèi)催化UDPG和F-6-P（6-磷酸果糖）反應生成G-6-P（6-磷酸葡萄糖）和UDP，G-6-P又在蔗糖-6-磷酸合成酶（SPP）作用下迅速降解為蔗糖和磷酸根離子，使得SPS催化的蔗糖合成反應實際上是不可逆的[10]。6-磷酸葡糖共價調(diào)控SPS活性，無機磷抑制SPS活性。另外，光照和滲透壓變化因為改變氧化磷酸化位點上的絲氨酸殘基也會影響SPS的活性[11]。

SPS基因在基因水平直接編碼調(diào)控SPS，SPS基因的分子生物學研究近年來取得了一系列進展?？寺∨c表達分析一直是分子生物學的重要組分，本文對SPS基因的克隆與表達分析展開綜述，為對該基因的進一步研究提供參考。

1 SPS基因克隆研究進展

1.1 SPS基因克隆方法

植物基因克隆方法相對成熟，主要有功能克隆，PCR擴增，轉(zhuǎn)座子或T-DNA標簽，定位克隆，差別雜交和減法雜交，mRNA差異顯示和人工合成克隆[12]等多種方法。目前，獲得SPS基因克隆最常用的、報道最多的方法是PCR擴增克隆法[13]。通過參考已知基因序列，從GenBank中下載保守序列，設計特異引物或簡并引物，以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下獲得特定DNA片段。這是一種快速簡便基因克隆方法。

Guangming Sun[14]等使用PCR擴增法從菠蘿中克隆了一個1 132 bp的SPS基因片段AC-SPS1。AC-SPS1基因?qū)儆贏家族，編碼377個氨基酸殘基，含有兩個絲氨酸特征殘基。除了設計特異性引物，還可以利用保守氨基酸序列設計簡并引物。通過設計簡并引物，獲得了菠蘿[15]中1 131 bp的不同家族SPS基因片段，其編碼的氨基酸序列與水稻、翠竹、高粱、小麥的SPS氨基酸序列同源性分別達到了85%、84%、82%和81%。

1.2 SPS基因克隆進展

SPS基因序列具有多樣性。Castleden[16]等人對已知的SPS基因序列進行分析，界定了植物SPS基因的4個大家族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ或者A、B、C、D）。依據(jù)這一標準，單子葉和雙子葉植物中廣泛存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個基因家族，而Ⅳ家族（包括Ⅳ1和Ⅳ2）基因家族到目前為止只在禾本科植物中發(fā)現(xiàn)。在模式植物擬南芥中有4個SPS基因。其中2個基因位于5號染色體上，屬于家族A。1個基因位于1號染色體上，屬于家族B。1個基因位于4號染色體上，屬于家族C?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的D家族SPS基因比較特殊，它編碼的SPS蛋白N末端和C末端的氨基酸殘基數(shù)要比A、B、C家族少80～90個。

不同SPS基因家族在不同的器官組織中相對含量是不盡相同的，它們所發(fā)揮的功能也存在差異。通過RNA干擾抑制煙草葉片SPS-A基因和SPS-C基因的表達，發(fā)現(xiàn)在缺乏SPS-C的情況下，淀粉不能被有效動員降解而合成蔗糖，說明SPS-C與淀粉降解后蔗糖的合成密切相關，SPS-A存在于所有組織，抑制SPS-A沒有觀察到明顯的表型變化[17]。所以克隆不同植物不同家族的SPS基因具有重要意義。

SPS基因首先在玉米中得以克隆[18]，之后在菠菜、甜菜、柑桔、蠶豆、水稻、甘蔗等多種作物中相繼克隆出來[19-21]。截止目前，在NCBI中檢索SPS基因，可以獲得83條核酸序列。其中可可樹SPS核酸序列GenBank中收錄最多，有7條。GenBank收錄SPS基因序列物種分布情況如圖1所示。

基因克隆是分子生物學的重要組成，是物種中存在特定基因的重要證據(jù)，是基因功能研究的基礎。不同植物中SPS基因數(shù)目不同。甘蔗屬于禾本科的單子葉植物，所以甘蔗基因組中至少有5個分別屬于5個不同家族的SPS基因。目前在甘蔗[22-23]中，已鑒定了3個SPS基因（GenBank登錄號分別為：AB001337、EU269038和AB001338），其中2個已獲得全長氨基酸序列（EU269038和AB001338），分別屬于A家族D家族。何文錦等2007年從甘蔗葉片中克隆了SOSPS2，cDNA長 3 013 bp，其中第59-2 953位是該基因的開放閱讀框，編碼964個氨基酸。葉冰瑩[24]等2011年通過反轉(zhuǎn)錄PCR技術分離克隆了SPS基因cDNA片段，序列分析表明，該cDNA片段包含1個3 183 bp的開放閱讀框，可編碼1 060個氨基酸。已克隆的甘蔗SPSⅢ基因有2個等位變異類型SPSⅢ-1和SPSⅢ-2，同源性達99%。親緣關系較近的，高粱屬的甜高粱——同為莖稈含糖量較高的物種，已克隆出全長DNA序列SPS3-1[25]。

在原核生物藍藻中存在光合作用，光合產(chǎn)物以蔗糖的形式轉(zhuǎn)運。John E. Lunn[26]等在藍藻中克隆到一個SPS基因，包含2 163 bp的ORF序列，將該基因編碼的氨基酸序列和高等植物的SPS氨基酸序列進行比對，表現(xiàn)出了35%～39%的同源性。表1列出了幾種重要植物中獲得的SPS基因序列信息以及它們和不同物種同源性比對結果。

2 SPS基因表達研究進展

2.1 SPS基因表達研究方法

植物的生長、發(fā)育是基因差異表達的結果，研究基因表達有實時熒光定量PCR、半熒光定量PCR、印記雜交、原位雜交等方法。關于SPS基因表達研究的文獻報道中，使用最多的是實時熒光定量PCR和印記雜交技術。

2.1.1 實時熒光定量PCR

在PCR 反應體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 反應進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法為實時熒光定量PCR技術[33]。該方法具有簡便、快速、高效等特點，在基因表達研究中廣泛應用。

在水稻[34]中，Naohiro Aokia等實時熒光定量PCR技術研究了5個SPS同源基因的表達特性。SPS1基因在源組織中大量表達，而SPS2、SPS6和SPS8基因在源、庫組織中等量表達。5個同源基因SPS1、SPS2、SPS6、SPS8和SPS11的差異表達決定了水稻在萌發(fā)期、苗期、抽穗期的發(fā)育特征。C P L Grof使用相同方法測定了5種SPS基因家族在甘蔗[35]中的表達規(guī)律，SPS基因B、C家族在未成熟葉和成熟葉中均大量表達，D1、D2家族在莖、葉等量表達，A家族在葉中表達水平較低。陳由強等研究了甘蔗中SPSⅡ基因在糖分積累不同時期表達量的變化規(guī)律。在糖分積累初期，SPSⅡ基因在莖中大量表達；在糖分積累中期，SPSⅡ基因在葉中大量表達。枸杞是茄科多年生灌木，蔗糖含量對其品質(zhì)起重要作用。王麗娟等[36]用實時熒光定量PCR技術研究了枸杞中SPS基因的表達規(guī)律，在枸杞花和果實中SPS基因表達量高，而在根和葉中表達量低。文心蘭在開花過程中SPS基因會大量表達，甜瓜根中SPS基因表達量低，枸杞花、根中SPS基因表達研究結果和文心蘭、甜瓜相關研究結果一致。采用熒光定量PCR技術分析巴西橡膠樹[37]中SPS基因的表達模式，膠乳中表達量最高，樹皮、葉、花、種子、根中表達均較低。

2.1.2 印記雜交技術

在基因操作中，把DNA或RNA、蛋白質(zhì)等在薄膜濾器上經(jīng)浸潤、固定后，于薄膜濾器上進行雜交，生成雜種分子的過程稱為印記雜交[38]。分析RNA的Northern blot、分析DNA的Southern blot、分析蛋白的Western blot技術在實時熒光定量PCR普及之前都廣泛用于基因表達分析。

Chengchao Zheng 利用Northern blot技術分析了CmSPS1基因在甜瓜中的表達情況：在葉、莖、成熟果實中都有CmSPS1基因表達，但是在根和花中沒有檢測到mRNA。對菠菜[39]根、葉柄葉片進行Western blot和 Northern blot 分析，發(fā)現(xiàn)SPS基因主要在葉中表達，在葉片快速生長的初期大量積累。Southern blot分析柑橘[40]CitSPS1基因，發(fā)現(xiàn)它一個低拷貝基因。暗處理玉米[41]12 h后，Northern blot 分析表明SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。

2.2 SPS基因表達的空間特異性和時間特異性

空間特異性也稱組織特異性或細胞特異性，在植物生長發(fā)育過程中，SPS基因表達按照不同組織空間順序出現(xiàn)，并且在不同組織中呈現(xiàn)不同的規(guī)律。時間特異性是指在植物不同功能需求的生長發(fā)育各個階段，SPS基因表達按特定的時間順序發(fā)生，基因表達量也隨時間順序發(fā)生變化。基因表達空間特異性和時間特異性均是不可逆的。

2.2.1 SPS基因表達的空間特異性

提取復活草根、葉組織的RNA，和特異性基因探針雜交，發(fā)現(xiàn)CpSPS2只在葉中表達，而CpSPS1在根、葉中都有表達，且CpSPS1轉(zhuǎn)錄豐度明顯高于CpSPS2。在溫州蜜桔所有器官中都有CitSPS1基因的轉(zhuǎn)錄，但是在幼葉、花和未成熟的果實中轉(zhuǎn)錄水平很低，在老葉和成熟果實中轉(zhuǎn)錄水平很高。甘蔗中基因表達分析表明，不同部位SPS基因表達量有差異，莖組織中SPSⅡ表達量占SPS基因轉(zhuǎn)錄總量的40%。甜菜[42]中，BvSPS1基因是一個低拷貝基因，主根中BvSPS1基因的轉(zhuǎn)錄水平高于葉中。SoSPS1基因在甘蔗[43]葉中大量表達，SoSPS2基因不僅在葉中還在根中表達，且轉(zhuǎn)錄水平相近。水稻[44]SPS1基因只在葉中表達，而不在根中表達。Champa Sengupta-Gopalan等研究了苜蓿[45]葉片和根中3個SPS基因的表達規(guī)律，一個屬于A家族（MsSPSA），2個屬于B家族（MsSPSB和MsSPSB3），MsSPSA基因在節(jié)間表達增強，MsSPSB基因和MsSPSB3基因在葉中表達增強。

從以上報道中可以發(fā)現(xiàn)，大部分植物根中SPS基因表達水平較低，這可能是因為根中不發(fā)生光合反應，沒有光合產(chǎn)物在根中合成蔗糖造成的；而在含糖量高的植物器官中，SPS基因表達水平較高，如巴西橡膠樹膠乳、溫州蜜橘果實、甘蔗莖桿中等等。

2.2.2 SPS基因表達的時間特異性

菠蘿成熟過程中SPS酶活不斷增強，在SPS催化下，蔗糖含量不斷增加，單糖含量不斷下降。在果實發(fā)育早期，SPS基因的表達量很低，授粉后20 d表達量開始增加，并在授粉后70 d達到頂峰，轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢和酶活力變化趨勢相同。SPS酶活和蔗糖含量在授粉后80 d達到最大，比SPS基因轉(zhuǎn)錄峰值晚10 d左右。這些實驗結果表明，SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平和SPS酶活確實存在一定相關性。甜瓜授粉25 d后檢測到CmSPS1基因表達，果實成熟時基因表達量達到峰值。甜瓜授粉30 d后SPS酶活開始增加，蔗糖積累開始增加。SPS基因表達和甜瓜SPS酶活力變化也存在一定相關性。在溫州蜜桔果實中3個SPS基因CitSPS1，CitSPS2和CitSPS3獨立表達調(diào)控。CitSPS1基因在果實發(fā)育全程都會表達，果實成熟階段（開花后223 d）表達量達到峰值，開花后178 d CitSPS2基因開始表達，CitSPS3基因在果實發(fā)育過程中都不表達。這些報道表明，在植物蔗糖含量大量增加的生長發(fā)育階段，SPS基因大量表達，且基因表達量峰值出現(xiàn)的時間早于蔗糖含量峰值出現(xiàn)的時間。這可能是因為SPS基因需要一定時間轉(zhuǎn)錄mRNA并翻譯成SPS才能發(fā)揮作用并影響植物的生理、生化過程。

2.3 非生物因素對SPS基因表達的影響

在特定環(huán)境下，非生物因素會對植物生長造成影響。SPS不僅是植物蔗糖代謝中的關鍵酶，還在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著多方面生物學功能，如參與植物的抗逆生理。已有研究發(fā)現(xiàn)SPS在抗寒、抗旱等生理過程中起重要作用[46]。在非生物因素處理下SPS基因的表達也會發(fā)生變化，且這種變化是可逆的（表2）。

Dorothea Bartels干旱處理復活草葉片，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片脫水初期SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平會增加，隨著干燥程度增加，SPS基因會降低到一個極低的轉(zhuǎn)錄水平，SPS基因轉(zhuǎn)錄水平會在葉片復水后24 h內(nèi)逐漸恢復。Dibyendu N. Sengupta研究了3個香蕉[47]品種Cavendish，Kanthali和 Monthan成熟過程中乙烯處理對SPS基因表達的影響。不同品種對乙烯的敏感程度不同。乙烯處理Cavendish后，SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平大量上調(diào)，Kanthali乙烯處理后，SPS基因轉(zhuǎn)錄水平溫和上調(diào)，而Monthan品種整個成熟過程中SPS基因轉(zhuǎn)錄都維持在一個較低的水平，且乙烯處理也沒有刺激SPS基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。2008年Dibyendu N. Sengupta又報道了香蕉[48]在生長素、傷害、低溫處理下SPS基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。生長素和低溫處理輕微增加了SPS基因的轉(zhuǎn)錄水平，而傷害處理降低了其轉(zhuǎn)錄水平。

非生物因素對SPS基因表達的影響主要表現(xiàn)在2個方面：當非生物因素變化使植物蔗糖合成增加時，SPS基因表達會上調(diào)。如增強植物光合作用或者提高培養(yǎng)基葡萄糖含量，在干旱、低溫等脅迫處理下蔗糖合成也會增加，蔗糖會作為信號轉(zhuǎn)導因子傳遞脅迫信號并誘導植物發(fā)生特定生理生化過程來適應環(huán)境變化；另一方面，當脅迫壓力持續(xù)過大影響到植物正常代謝活動時，SPS基因表達就會迅速降低。

3 展望

3.1 SPS基因在蔗糖代謝中的研究前景

盡管許多研究都表明SPS基因確實參與了植物蔗糖代謝，但是蔗糖代謝過程極其復雜，中間涉及多種基因的相互作用。在桃中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6種非同源基因[49]參與了蔗糖代謝，在這些基因中，SPS基因研究最深入，未來將會更精確的定位其在植物蔗糖代謝通路中發(fā)揮的作用。SPS基因被認為是最有發(fā)展前景的蔗糖代謝相關基因之一。

蔗糖含量、蔗糖代謝酶活性、蔗糖代謝基因轉(zhuǎn)錄水平三者之間的動態(tài)變化規(guī)律一直是研究熱點?，F(xiàn)在很多植物中都有了報道，但還缺乏系統(tǒng)認識，仍然需要在更多的植物中開展相關研究。SPS是重要的蔗糖代謝酶，過去SPS研究多集中在蛋白水平，未來將會更深入研究SPS基因，探索SPS基因的表達規(guī)律并通過轉(zhuǎn)基因技術對其進行功能驗證。

3.2 SPS基因的應用前景

全球能源危機也日趨嚴重，清潔可再生的生物質(zhì)能源應用前景廣闊，但是一直受到原料轉(zhuǎn)化率低的限制。提高生物質(zhì)能源原料中蔗糖含量無疑是提高原料轉(zhuǎn)化率有效且可行的辦法之一。SPS基因是植物蔗糖代謝中的一個重要基因[50]，可能是提高植物中蔗糖含量的關鍵基因。對SPS基因進行更深入研究并通過轉(zhuǎn)基因技術提高生物質(zhì)能源原料中蔗糖含量可以突破原料轉(zhuǎn)化率低這一限制生物質(zhì)能源利用的瓶頸，SPS基因應用前景非常廣闊。

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