喬俊卿， 陳志誼， 梁雪杰， 劉永鋒， 劉郵洲

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014)

枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生強(qiáng)抗逆性的內(nèi)生芽孢，其抑菌譜廣，對(duì)多種植物病害具有良好防效，且對(duì)植物具有促生作用。已有研究結(jié)果表明，芽孢桿菌防治植物病害的機(jī)制主要有:與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位點(diǎn)、分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌的生長(zhǎng)和激發(fā)植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性［1］。然而，生防菌防治植物病害的先決條件是其在引進(jìn)位點(diǎn)能夠有效定殖［2-3］。因此，生防菌的定殖能力及動(dòng)態(tài)規(guī)律研究已經(jīng)成為生防微生物篩選、研發(fā)的重要參考指標(biāo)。

生防菌在植物根際的有效定殖具有以下特征:能夠吸附在植物根表面;能夠在生長(zhǎng)的植物根系上定殖;能夠利用種子或根系泌出液為營(yíng)養(yǎng)繁殖擴(kuò)展［4］。生防芽孢桿菌通常以生物膜的形式定殖于植物根際。生物膜可以提高生防菌的生存競(jìng)爭(zhēng)力，幫助其抵抗抗生素等環(huán)境壓力，逃避原生動(dòng)物的捕食;生物膜還能維持生防菌在植物根部的定殖數(shù)量，從而提高細(xì)菌分泌的胞外酶和抗生素的濃度，使其達(dá)到有效濃度，保證生防菌發(fā)揮正常的生防和促生作用［5］。芽孢桿菌生物膜主成分是胞外多糖、TasA蛋白、多聚谷氨酸以及一些DNA等物質(zhì)［6］。因此，生物膜的主成分是影響芽孢桿菌在植物根際定殖的重要因子。

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害與生防研究室經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，積累了大量的生防菌株資源，并開(kāi)發(fā)了相關(guān)產(chǎn)品，如防治水稻紋枯病的生物制劑“紋曲寧”［7-9］和防治水稻細(xì)菌性病害的“葉斑寧”等［10-11］。研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌 Bs916(紋曲寧主要活性成分)對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌都具有抑制作用;全基因組測(cè)序和質(zhì)譜檢測(cè)顯示，Bs916可產(chǎn)生多種脂肽類和聚酮類抗生素，如表面活性素、桿菌霉素L等［12-14］。本研究擬在Bs916全基因組測(cè)序平臺(tái)和其抑制番茄青枯病菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析Bs916生物膜形成的關(guān)鍵基因，研究其生物膜形成能力，并采用植物MS平板定殖研究法和溫室盆栽試驗(yàn)評(píng)估Bs916在番茄根部的定殖能力和規(guī)律，旨在為芽孢桿菌Bs916防治番茄青枯病的田間應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)用病原菌番茄青枯菌(Ralstonia solanacearum，RSQ)和生防菌(Bacillus subtilis Bs916)及其綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記菌株Bs916G均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害與生防研究室保存?？莶菅挎邨U菌活化和發(fā)酵均用改良酵母膏蛋白胨葡萄糖(Yeast peptone glucose，YPG)培養(yǎng)基(酵母膏5 g、胰蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、pH 7.0～7.2，固體培養(yǎng)基需加瓊脂15 g)。菌株Bs916G由姚震聲［15］構(gòu)建，其抗生素使用濃度為:氯霉素(Cm)，5 μg/ml。番茄青枯病菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient agar，NA)培養(yǎng)基(牛肉浸膏 3 g、酵母膏 1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1 000 ml，固體培養(yǎng)基需加瓊脂15 g)活化培養(yǎng)。試驗(yàn)所用番茄品種為巨粉寶，枯草芽孢桿菌在無(wú)菌番茄根部定殖試驗(yàn)采用植物普通組培(Murashige and skoog，MS)培養(yǎng)基(購(gòu)自荷蘭 Duchefa Biochenie 公司)［16］。

1.2 平板對(duì)峙試驗(yàn)

將枯草芽孢桿菌Bs916和Bs916G在YPG固體平板活化，挑取單菌落入YPG液體培養(yǎng)基發(fā)酵，33℃、150 r/min振蕩培養(yǎng) 48 h(菌含量:2×109CFU/ml)。番茄青枯病菌在NA固體培養(yǎng)基上活化，移入50 ml NA培養(yǎng)液中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，吸取青枯菌液涂布空白NA平板(0.2 ml菌液/平板，青枯菌含量:1×108CFU/ml)。NA平板四周呈十字架型打4個(gè)直徑5 mm的小孔(離培養(yǎng)皿中心距離約為30 mm)，每孔上滴入生防菌液5 μl。每處理重復(fù)3皿。28℃恒溫培養(yǎng)2 d后，調(diào)查抑菌圈直徑。

1.3 芽孢桿菌生物膜形成能力檢測(cè)

芽孢桿菌Bs916和Bs916G的生物膜形成能力在MSgg培養(yǎng)液中進(jìn)行評(píng)估。MSgg培養(yǎng)基配方如下:磷酸鉀5 mmol/L，Mops(pH=7)100 mmol/L，MgCl22 mmol/L， CaCl2700 μmol/L， FeCl350 μmol/L，MnCl250 μmol/L，ZnCl21 μmol/L，硫胺素2 μmol/L，甘油0.5%，谷氨酸0.5%、色氨酸50 mg/L，苯丙氨酸50 mg/L［6］。將芽孢桿菌Bs916和Bs916G分別接種于10 ml YPG液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)16 h。然后取5 μl培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接到含有3 ml MSgg培養(yǎng)液的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)菌株接4孔，重復(fù)3次。37℃靜置培養(yǎng)24～48 h后，觀察生物膜形成情況。

1.4 Bs916在無(wú)菌番茄根部的定殖

Bs916發(fā)酵48 h后收集菌體，并用滅菌0.9%NaCl稀釋至OD600為1.0待用(菌含量約為5×107CFU/ml)。番茄種子于3%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min滅菌，無(wú)菌水沖洗至無(wú)味，置于Bs916生防菌液中浸泡24 h，種子晾干后，播種于MS瓊脂平板，每平板播種5粒，重復(fù)3次，靜置于28℃光照培養(yǎng)箱。15 d后，稱取番茄根，將其研磨后用無(wú)菌水按照倍比稀釋法，涂布YPG固體平板，檢測(cè)生防菌Bs916在番茄根部的定殖數(shù)量。

1.5 盆栽定殖

GFP標(biāo)記菌株Bs916G于YPG中發(fā)酵48 h，收集菌液待用，測(cè)定原液菌含量，約為 2×109CFU/ml。番茄青枯菌RSQ于NA培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，收集菌液待用，菌含量約1×109CFU/ml。自然土過(guò)篩，與營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按1∶1∶1配比，將催芽的番茄種子播入其中，待番茄苗4葉1心時(shí)定植于單獨(dú)盆缽中。盆栽定殖試驗(yàn)共3個(gè)處理，分別是單澆Bs916G菌液處理(Bs916G)、先澆 Bs916G菌液后澆青枯菌處理(Bs916G+RSQ)和澆無(wú)菌水對(duì)照(CK)，每處理15缽，重復(fù)3次。番茄定植前，需澆生防菌的處理，先將番茄苗在生防菌液中浸根20 min，待定植后，每棵苗根圍再澆Bs916G菌液20 ml;Bs916G+RSQ處理中，每棵苗需同時(shí)灌根青枯病菌菌液10 ml;對(duì)照處理中，番茄苗在無(wú)菌水中浸根20 min，定植后并灌根無(wú)菌水20 ml。灌根處理后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d 定期采集番茄根，每次取苗3棵，抖落根土，并稱取根部1 g，用無(wú)菌水振蕩洗滌，倍比稀釋后，分別涂布含有10 μg/ml氯霉素的YPG平板，28℃靜置培養(yǎng)48～72 h后，統(tǒng)計(jì)枯草芽孢桿菌Bs916G菌落數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan's新復(fù)極差法分析不同處理間差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌Bs916生物膜形成關(guān)鍵基因的發(fā)掘

全基因組序列分析顯示，枯草芽孢桿菌Bs916含有完整的生物膜形成關(guān)鍵基因(簇)，包括胞外多糖(EPS)合成酶編碼基因簇、TasA蛋白和γ-多聚谷氨酸聚合酶編碼基因簇(表1)。其中胞外多糖(EPS)合成酶編碼基因簇大小為15 715 bp，包含15個(gè)編碼基因，與已報(bào)道的氨基酸序列同源性達(dá)99%～100%;TasA蛋白編碼基因大小786 bp，與已報(bào)道蛋白同源性達(dá)100%;γ-多聚谷氨酸聚合酶編碼基因簇大小為4 369 bp，與已報(bào)道的相關(guān)氨基酸序列同源性達(dá)96%～100%。3個(gè)完整且高度同源的編碼基因(簇)是Bs916生物膜形成的有利遺傳保障。

表1 枯草芽孢桿菌Bs916生物膜形成關(guān)鍵基因(簇)信息Table 1 The details of gene clusters related to biofilm formation in Bacillus subtilis Bs916

2.2 GFP標(biāo)記菌株Bs916G的拮抗活性穩(wěn)定性及生物膜形成能力

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，枯草芽孢桿菌Bs916及其GFP標(biāo)記菌株Bs916G對(duì)番茄青枯病菌均顯示較好的抑制作用，抑菌圈直徑都在13 mm左右，且無(wú)顯著差異，這表明GFP的表達(dá)并未影響B(tài)s916對(duì)番茄青枯菌的拮抗效果。此外，生物膜形成能力結(jié)果(圖1)顯示，Bs916和Bs916G在MSgg培養(yǎng)基中都能夠形成生物膜，且質(zhì)地厚實(shí)，多皺褶。這也表明GFP的表達(dá)并不影響芽孢桿菌Bs916生物膜的形成能力。

表2 枯草芽孢桿菌Bs916和Bs916G對(duì)番茄青枯菌的拮抗作用Table 2 Antagonistic activity of Bacillus subtilis Bs916 and Bs916G against R.solanacearum

2.3 枯草芽孢桿菌Bs916在無(wú)菌番茄根部的定殖能力

如圖2所示，在MS平板試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌Bs916浸種的番茄根系兩側(cè)均看到白色菌痕，而未浸種的番茄根系兩側(cè)并無(wú)菌痕，這表明Bs916能夠利用番茄根系分泌物在番茄根際定殖生存。平板回收測(cè)定Bs916的定殖含量顯示，Bs916在番茄根部的定殖量為每1 g根3.1×107CFU。

圖1 枯草芽孢桿菌Bs916和Bs916G生物膜Fig.1 The biofilm of Bacillus subtilis Bs916 and Bs916G in MSgg medium

圖2 Bs916在MS平板試驗(yàn)中的番茄根部定殖情況Fig.2 Colonization of Bs916 on tomato roots in the MS plate

2.4 枯草芽孢桿菌Bs916G在盆栽番茄根部的定殖動(dòng)態(tài)變化

利用GFP標(biāo)記菌株Bs916G灌根番茄苗后，通過(guò)抗性平板回收法檢測(cè)Bs916G在番茄根部的定殖情況，結(jié)果顯示:單獨(dú)灌根 Bs916G的處理中，Bs916G在番茄根部的定殖數(shù)量呈現(xiàn)先下降后逐漸上升的趨勢(shì)，即灌根1 d后，番茄根表定殖量可以達(dá)到1×109CFU/g，第5 d下降到最低點(diǎn)，僅為每1 g根1×106CFU，隨后逐步回升達(dá)到1×107CFU/g，第7 d、14 d穩(wěn)定在1×107CFU/g。在灌根Bs916G并同時(shí)接種青枯菌的處理中，Bs916G的定殖數(shù)量變化趨勢(shì)和未接種處理基本一致，其定殖數(shù)量也基本相近，但在第14 d時(shí)，Bs916G的定殖量明顯比未接種低約10倍，僅為1×106CFU/g(圖3)。

3 討論

芽孢桿菌生物膜的成分主要是胞外多糖、TasA蛋白和γ-多聚谷氨酸。胞外多糖由eps操縱子負(fù)責(zé)合成，該操縱子編碼胞外多糖合成酶，TasA蛋白由tasA負(fù)責(zé)合成并泌出到胞外［17］。Chen等研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌單獨(dú)突變eps或tasA基因，雖然能產(chǎn)生微弱的生物膜，但其在番茄根部的定殖能力下降，而eps和tasA的雙突變體不產(chǎn)生任何生物膜，在番茄根部基本不能定殖［18-19］。本研究結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌Bs916中具有完整的生物膜形成關(guān)鍵基因(簇)，包括胞外多糖(EPS)合成酶編碼基因簇，TasA蛋白和γ-多聚谷氨酸聚合酶編碼基因簇，其大小分別為15 715 bp、786 bp和4 369 bp，與已報(bào)道的相關(guān)氨基酸序列同源性達(dá)96%～100%。同時(shí)，本研究的后續(xù)試驗(yàn)已經(jīng)構(gòu)建了tasA基因的突變體，并發(fā)現(xiàn)該突變體的生物膜形成能力嚴(yán)重下降，在番茄根系定殖能力減弱，這與Chen等［19］報(bào)道的結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，生物膜是芽孢桿菌在植物根部定殖的重要存在形式。

圖3 枯草芽孢桿菌Bs916G在盆栽番茄根部的定殖動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamics of colonization of B.subtilis Bs916G on the root of tomato over time

綠色熒光蛋白(GFP)是一種良好的標(biāo)記物，近年來(lái)，GFP被廣泛應(yīng)于標(biāo)記生防芽孢桿菌，用來(lái)觀察和研究生防菌在植物根部的行為和互作方式［20-21］。劉郵洲等利用GFP標(biāo)記枯草芽孢桿菌PTS-394，并進(jìn)行了其在番茄根圍定殖的觀察研究［22］。本研究首先比較了GFP標(biāo)記的枯草芽孢桿菌Bs916G與野生型Bs916的生物膜形成能力和抑制番茄青枯菌的能力，確認(rèn)兩者無(wú)顯著差異后，利用GFP標(biāo)記菌株進(jìn)行其在番茄根部的定殖動(dòng)態(tài)和規(guī)律研究，為生防芽孢桿菌Bs916田間防治番茄青枯病奠定了理論基礎(chǔ)。

生防芽孢桿菌施用后，穩(wěn)定的定殖能力是其發(fā)揮生防、促生作用的關(guān)鍵因素［23］，因此，生防菌的定殖能力及動(dòng)態(tài)規(guī)律研究已經(jīng)成為生防微生物篩選、研發(fā)的重要參考指標(biāo)之一。劉慶豐等［24］報(bào)道，枯草芽孢桿菌XF-1能在大白菜根圍、根表和根內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間定殖，有利于占據(jù)有利生態(tài)位點(diǎn)，從而抑制白菜根腫病菌的侵染和繁殖。本試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌Bs916能夠在番茄根部定殖，其在番茄根部的定殖數(shù)量呈現(xiàn)先下降后逐漸上升的趨勢(shì)，即使接種青枯菌，Bs916的定殖數(shù)量的變化趨勢(shì)和未接種處理也基本一致，但在第14 d時(shí)，其定殖量明顯比未接種低約10倍。以上結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌Bs916可以在番茄根部有效定殖，這是其在田間發(fā)揮防治番茄青枯病的重要保障因素。

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