梁 菊 來丹玉 吳文瀾 李國芝 李軍波 方財林(河南科技大學化工與制藥學院,河南洛陽4703;河南科技大學醫(yī)學院,河南洛陽4703)

三條兩親性多肽的自組裝行為及酸敏特性

梁 菊1,*來丹玉1吳文瀾2李國芝1李軍波1方財林1
(1河南科技大學化工與制藥學院,河南洛陽471023;2河南科技大學醫(yī)學院,河南洛陽471023)

通過固相合成法制備了三條疏水端不同的兩親性多肽VVVVVVKKGRGDS(AP1)、C12KKGRGDS (AP2)、FAFAFAKKGRGDS(AP3).自組裝行為研究表明,三條多肽在中性條件下(pH 7.0)均能形成球形納米膠束,透射電子顯微鏡(TEM)檢測其粒徑為～30 nm,動態(tài)光散射(DLS)測試其粒徑分布均一.當pH下降為5.0時,肽鏈AP1的膠束結(jié)構(gòu)被破壞,TEM視野中沒有發(fā)現(xiàn)任何自組裝體,而肽鏈AP2和AP3的膠束結(jié)構(gòu)在pH 5.0時依然存在,但AP2的納米粒子之間明顯發(fā)生了部分聚集,表現(xiàn)為團聚樣分布,AP3組裝體的粒徑明顯增大,形貌變得不規(guī)則.DLS測試結(jié)果顯示,當pH下降到5.0時,肽鏈AP1在1-1000 nm范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)吸收峰,AP2呈多峰分布,AP3呈寬單峰分布.DLS的測試結(jié)果很好地印證了TEM的測試結(jié)果.為了探究三條多肽組裝性能不同的二級結(jié)構(gòu)因素,我們對AP1、AP2和AP3進行了圓二色譜(CD)和傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜測試.結(jié)果表明,三條多肽在中性條件下二級結(jié)構(gòu)中均存在一定含量的β-折疊,當pH下降到5.0時,AP1結(jié)構(gòu)中的β-折疊成分顯著下降,出現(xiàn)部分無規(guī)卷曲.AP2和AP3的β-折疊成分雖有變化,但其CD主峰依然存在.以姜黃素作為模型藥物,進一步確認AP1載藥膠束的釋藥行為也具有優(yōu)良的酸敏感特性.AP1、AP2和AP3在酸性條件下自組裝行為的不同,表明調(diào)控兩親性多肽的疏水端組成有可能是調(diào)控多肽自組裝性能的有效手段.AP1組裝體有望成為理想的pH響應性載體材料.

自組裝;納米膠束;酸敏感材料;圓二色譜;傅里葉變換紅外光譜;多肽二級結(jié)構(gòu)

1 引言

多肽由于自身具有良好的生物相容性和多樣的生理功能,作為一類新型的載體材料,在納米科學和材料學等領域引起了學者們的極大興趣,1-4尤其是兩親性多肽優(yōu)良的組裝性能,近年來其自組裝研究日益成為國際上的熱點.

兩親性多肽的概念最早由Kunitake5提出,這類多肽含有一個親水頭和一條疏水尾巴,通過合理調(diào)控結(jié)構(gòu)中疏水性尾部長短、間隔區(qū)以及親水性頭部的長短可以得到膠束、囊泡、層膜、納米纖維、納米管、納米盤等組裝體.6-8例如,Zhang等9對完全由氨基酸殘基組成的兩親性多肽分子進行了研究,如A6D、V6D、V6K2等,結(jié)果表明這些小分子多肽可以自組裝形成納米管和囊泡結(jié)構(gòu).Yang等10合成了一系列兩親性多肽((AmX)nH5K15),研究了這些多肽分子的自組裝行為,結(jié)果表明(AF)6H5K15可以自組裝成穩(wěn)定的納米膠束.Wang等11研究表明,在功能肽R8的N端引入疏水烷基鏈可以幫助多肽分子形成穩(wěn)定的組裝體.親水端的非共價鍵,如氫鍵作用和疏水端的疏水締合作用是組裝的根本動力,12但目前各種形貌組裝體的形成主要是通過調(diào)整肽鏈的親、疏水端的長短而實現(xiàn).

通常來說,兩親性多肽疏水端的組成可以是脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸或者烷基鏈.在水溶液中,脂肪族氨基酸之間可以通過弱的疏水締合作用結(jié)合在一起,烷基鏈和烷基鏈之間同樣可以通過疏水締合作用結(jié)合,而芳香族氨基酸之間則存在強烈的π-π堆積作用.13因此,疏水端成分的不同,會直接影響兩親性多肽在水中的締合能力和組裝性能.因此,我們設想改變兩親性多肽的疏水端組成,設計合成疏水端不同的兩親性多肽,研究和比較它們的組裝性能,為調(diào)控兩親性多肽的組裝性能提供新的思路和方法.

鑒于以上研究背景,本文設計制備了三條親水端為KKGRGDS,疏水端不同的兩親性小分子多肽VVVVVVKKGRGDS(AP1)、C12KKGRGDS(AP2)、FAFAFAKKGRGDS(AP3),研究三條兩親性多肽分子的自組裝性能和酸敏特性,試圖為設計和尋找新的功能化載體材料提供重要參考.

2 實驗原料

Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val (Fmoc)-OH、Fmoc-Phe(Fmoc)-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-OH,O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)以及2-氯-三苯甲基氯樹脂(100-200目,取代度0.4 mmol·g-1,1%二乙烯基苯(DVB)均購于上海吉爾生化有限公司,可直接使用.哌啶、三氟乙酸(TFA)、二甲基亞砜(DMSO)、1,2-乙二硫醇(EDT)、苯酚、硬脂酸均購自國藥集團(上海)化學試劑公司,直接使用.苯甲硫醚于Acros購得.二異丙基乙胺(DiEA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)購自上海化學試劑公司,加無水硫酸鎂干燥,重蒸后使用.姜黃素(Curcumin)購于阿拉丁試劑公司,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)從Gibco購得.

3 小分子多肽的制備及其表征

3.1 小分子多肽的制備

采用多肽固相合成法,14-16以“Fmoc化學”策略手動合成,17AP1、AP2、AP3其化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

以AP1多肽的合成為例,具體步驟如下:(1)樹脂溶脹:稱取1.5 g 2-氯-三苯甲基氯樹脂(取代度0.4 mmol·g-1)加于含有DMF的反應柱中,攪拌1 h以充分溶脹樹脂.(2)氨基酸縮合:除去DMF,加入Fmoc-Ser(tBu)-OH和DiEA的DMF溶液.其中,氨基酸和DiEA的投料量分別相當于樹脂中氯取代度的2倍(1.2 mmol)和4倍(2.4 mmol),室溫下攪拌2 h.(3)甲醇封閉:用DMF洗滌3次后,加入含有過量甲醇和2.4 mmol DiEA的DMF混合溶液繼續(xù)攪拌1 h,使樹脂中未參與氨基酸連接反應的活性氯基團完全封閉.(4)脫Fmoc保護:DMF洗滌3次后,加入15 mL 20%哌啶/DMF(體積比)溶液攪拌,除去多肽序列末端氨基酸上的Fmoc保護基,處理10 min,2次,之后用DMF洗滌4次.然后,將1.8 mmol Fmoc保護氨基酸、2.4 mmol HBTU、2.4 mmol HOBt和3.6 mmol DiEA溶解于DMF中,活化羧基后加入反應柱,重復步驟(2),完成后續(xù)氨基酸的縮合反應.反應完畢,用茚三酮的甲醇溶液(10 mg·mL-1)驗證氨基是否縮合完全,若溶液發(fā)藍或發(fā)紅表示縮合不完全,需重復縮合步驟,若溶液為明亮黃色或未變色,表示此步縮合反應完成.用4×10 mL CH2Cl2洗滌樹脂,充分洗干,于真空干燥箱中干燥24 h,得目標多肽.用電噴霧電離質(zhì)譜儀(ESI-MS)檢測多肽的分子量,通過多電荷峰計算分子量與理論值一致,確認三條肽鏈的化學結(jié)構(gòu)正確.

圖1 三條兩親性多肽的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of the molecular structures of three amphiphilic peptides

3.2 多肽組裝體的TEM測試和DLS測試

將多肽AP1、AP2和AP3直接溶解于pH 7.0的二次蒸餾水和pH 5.0的稀鹽酸溶液中,靜置數(shù)分鐘.18多肽組裝體的形貌用透射電子顯微鏡(JEM-100CX II型,Japan)觀測.樣品制備過程:將帶有Formvar膜的銅網(wǎng)在多肽溶液中浸泡后取出,沉積數(shù)分鐘后吸去多余的液體,之后用磷鎢酸溶液負性染色,干燥后進行觀測.多肽組裝體在水相中的粒徑以及粒徑分布通過動態(tài)光散射儀(DLS)在37°C的環(huán)境下進行測定.

3.3 多肽組裝體的二級結(jié)構(gòu)研究

將pH 7.0和pH 5.0多肽AP1、AP2和AP3的水溶液分別置于體積為200μL、厚度為0.5 mm的石英樣品池中,用圓二色譜(CD)儀(J-810型,Jasco Ltd.)分析自組裝多肽的二級結(jié)構(gòu).掃描波長范圍為185-500 nm,掃描速率為0.25 nm·s-1,最終的CD圖譜為3次掃描的疊加.

將pH 7.0和pH 5.0多肽AP1、AP2和AP3的水溶液于-45°C下冷凍干燥.分別取少量pH 7.0和pH 5.0的凍干粉和KBr研磨壓制成圓片,使用紅外分光光度計(AVATAR 360型,Perkin-Elmer)檢測樣品的紅外吸收光譜.

3.4 AP1的藥物包載及體外釋藥

將多肽AP1(10 mg)與姜黃素(2 mg)溶解于5 mL DMSO中,置于截留分子量為1000 Da的透析袋中,將其放入裝有2000 mL pH 7.0的PBS中透析4 h.4 h后將PBS更換為pH 7.0的二次蒸餾水,繼續(xù)透析24 h.19

將包載了姜黃素的多肽組裝體冷凍干燥后溶解于1 mL的DMSO中,在485 nm處測得藥物的紫外吸收值,從標準工作曲線中計算出組裝體對姜黃素的包封率(EE)和載藥量(LL).包封率和載藥量分別定義如下:

藥物包載完畢后,將透析袋直接浸入裝有10 mL二次蒸餾水的50 mL離心管中,于37°C下進行體外藥物釋放實驗(振蕩器轉(zhuǎn)速為120 r·min-1).按設定的時長,每隔一段時間取出離心管中的全部溶液,另加10 mL新鮮的蒸餾水至離心管中.姜黃素的含量通過熒光光度計(LS55型,Perkin-Elmer)測定.姜黃素的最大激發(fā)波長為440 nm,最大發(fā)射波長為530 nm.通過標準工作曲線計算藥物濃度.實驗采用3組平行樣釋藥,通過平均值得到相應的積累釋放量.

4 實驗結(jié)果與討論

4.1 多肽組裝體的形貌研究

多肽組裝體的形貌通過TEM觀察,如圖2所示.結(jié)果表明,三條多肽在中性條件下(pH 7.0)能形成形態(tài)均一的小尺寸納米膠束(圖2(a-c)),TEM顯示其粒徑均為～30 nm.當pH下降為5.0時,多肽分子AP1的膠束結(jié)構(gòu)被破壞,TEM視野中沒有發(fā)現(xiàn)任何自組裝體.多肽AP2和AP3的膠束結(jié)構(gòu)在pH 5.0時依然存在,但AP2的納米粒之間明顯發(fā)生了部分聚集,表現(xiàn)為團聚樣或纖維狀分布,AP3的膠束粒徑增大,形貌變得不規(guī)則(圖2(d,e)).

圖2 三種兩親性多肽自組裝體在中性(pH 7.0)(a:AP1;b:AP2;c:AP3)和酸性(pH 5.0)(d:AP2;e:AP3)介質(zhì)中的TEM圖片F(xiàn)ig.2 TEM images of three self-assembled amphiphilic peptides in neutral medium(pH 7.0)

同時,我們利用DLS對三條多肽的粒徑和粒徑分布進行了檢測.結(jié)果顯示,中性條件下,AP1、AP2和AP3的平均粒徑分別為～89 nm(PDI 0.239)、～142 nm(PDI 0.371)和～116 nm(PDI 0.208),三者在中性條件下的自組裝性能良好,形成了形態(tài)均一的納米膠束,與TEM的測試結(jié)果相符合.酸性條件下(pH 5.0),AP1的DLS結(jié)果顯示,在1-1000 nm范圍內(nèi)未檢測到吸收峰的出現(xiàn),AP2和AP3的DLS吸收峰呈現(xiàn)多重峰或?qū)挿宸植?推測原因是由于酸性條件下,膠束發(fā)生了團聚或形貌變的不規(guī)則,這個結(jié)果也在一定意義上佐證了TEM的測試結(jié)果.三條多肽的DLS測試結(jié)果如圖3所示.

4.2 多肽的二級結(jié)構(gòu)研究

圓二色譜和傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜測試發(fā)現(xiàn),pH 7.0時多肽AP1在水溶液中存在部分β-折疊構(gòu)象,在195 nm處出現(xiàn)正峰,而當pH下降為5.0時,此處的吸收峰消失,出現(xiàn)典型的無規(guī)卷曲峰形.從FT-IR圖譜來看,pH 7.0時AP1在酰胺I帶(1600-1700 cm-1)1634和1680 cm-1處出現(xiàn)了強吸收的β-折疊特征峰,而在pH 5.0時該處的吸收峰相對強度明顯減弱.多肽AP2和AP3在pH 7.0時,其CD圖譜顯示,與AP1相似,同樣存在一定的β-折疊構(gòu)象,在195 nm處出現(xiàn)正峰,當pH下降到5.0時,AP2在195 nm處仍然出現(xiàn)正峰,但峰型稍變寬,多肽AP3在pH 5.0時,195 nm處的峰出現(xiàn)裂分,強度下降.多肽AP2和AP3在pH 7.0時的FT-IR圖譜同樣出現(xiàn)了酰胺I帶特征的β-折疊峰,分別位于1629、1686 cm-1和1630、1682 cm-1.當pH下降到5.0時,AP2和AP3酰胺I帶吸收峰的強度變化不明顯,但AP2的峰型明顯變寬.由此可以看出,隨著pH下降,多肽AP1分子結(jié)構(gòu)中β-折疊的相對含量下降,AP2和AP3結(jié)構(gòu)中的β-折疊成分雖有變化,但其CD主峰依然存在.三條多肽在pH 7.0和pH 5.0時的CD圖譜和FT-IR圖譜如圖4和圖5所示.

圖3 三種兩親性多肽自組裝體在中性(pH 7.0)(a:AP1;b:AP2;c:AP3)和酸性(pH 5.0)(d:AP2;e:AP3)介質(zhì)中的粒徑分布情況Fig.3 Size distribution of three self-assembled amphiphilic peptides in neutral medium(pH 7.0) (a:AP1;b:AP2;c:AP3)and acid medium(pH 5.0)(d:AP2;e:AP3)

圖4 三種多肽自組裝體在中性(pH 7.0)和酸性(pH 5.0)介質(zhì)中的CD圖譜Fig.4 CD spectra of three self-assembled peptides in neutral medium(pH 7.0)and acidic medium(pH 5.0)

圖5 三種多肽自組裝體在中性(pH 7.0)和酸性(pH 5.0)介質(zhì)中的FT-IR圖譜Fig.5 FT-IR spectra of three self-assembled peptides in neutral medium(pH 7.0)and acidic medium(pH 5.0)

4.3 多肽AP1的藥物包載及藥物釋放行為

為測試多肽AP1的藥物包載和釋放能力,選用疏水性抗癌藥物姜黃素作為模型藥物,研究了AP1的體外藥物釋放行為.結(jié)果顯示,AP1組裝的納米膠束對姜黃素的包封率和載藥量分別為(4.06±0.30)%和(1.60±0.10)%.從所測得數(shù)據(jù),可以看出AP1納米膠束對姜黃素的包封率和載藥量較小,分析原因可能是多肽AP1疏水端VVVVVV形成的膠束內(nèi)核相對較小導致的.我們對AP1載藥膠束進行了體外釋藥研究,結(jié)果顯示,pH 7.0時姜黃素的釋放速率緩慢,72 h的累積釋藥量僅為28%,當改變釋藥介質(zhì)pH為5.0后,姜黃素的釋放出現(xiàn)了暴釋現(xiàn)象,4 h的累積釋藥量達到86%,表明AP1載藥膠束的釋藥行為也具有顯著的酸依賴性(如圖6所示).

圖6 中性(pH 7.0)和酸性(pH 5.0)介質(zhì)中姜黃素從AP1載藥膠束中的釋藥行為Fig.6 Release behavior of curcumin fromAP1 micelles in neutral medium(pH 7.0)and acidic medium(pH 5.0)

5 結(jié)論

設計制備了三種新型的兩親性多肽VVVVVV KKGRGDS(AP1)、C12KKGRGDS(AP2)、FAFAFAK KGRGDS(AP3).在中性介質(zhì)(pH 7.0)中,三條多肽均能形成形態(tài)均一的小尺寸納米膠束,當pH下降為5.0時,多肽AP1的膠束結(jié)構(gòu)被破壞,而AP2和AP3的膠束結(jié)構(gòu)依然存在,表明多肽AP1的自組裝行為具有顯著的酸敏感特性.CD和FT-IR測試結(jié)果進一步證實了在中性和酸性條件下多肽AP1的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,AP2和AP3的二級結(jié)構(gòu)特征變化不明顯.分析三條多肽的分子結(jié)構(gòu)(如圖1所示),我們可以看出,多肽AP1的疏水端是VVVVVV,親水端是KKGRGDS,在中性條件下,疏水端通過疏水締合作用,親水端通過氫鍵作用形成殼核結(jié)構(gòu)狀的穩(wěn)定膠束,當改變環(huán)境為酸性時,親水端賴氨酸(K,pKa=10.54)和精氨酸(R,pKa=12.48)殘基的離子化程度加劇,導致多肽分子間的靜電斥力增強,削弱了多肽分子間的氫鍵作用力,再加上疏水端VVVVVV之間的疏水締合作用也比較弱(V的側(cè)基脂肪鏈為異丙基,屬于較短的脂肪鏈),導致膠束穩(wěn)定性下降,膠束結(jié)構(gòu)消失.多肽AP2和AP3在酸性條件下的膠束結(jié)構(gòu)雖然有變化,但依然存在組裝體,分析原因可能是因為AP2和AP3的親水端雖然和AP1相同,但他們的疏水端分別是C12脂肪鏈和FAFAFA,C12脂肪鏈之間存在較強的疏水締合作用,而F和F之間具有較強的π-π堆積力,這種疏水端較強的作用力導致其在酸性條件下依然可以形成組裝體.據(jù)此,我們可以推斷兩親性多肽疏水端疏水締合作用的強弱是影響其自組裝穩(wěn)定性的重要因素.這種疏水端變化導致兩親性多肽自組裝穩(wěn)定性發(fā)生變化的現(xiàn)象對設計新的功能化多肽材料具有重要的借鑒意義,值得我們后續(xù)去深入研究.

腫瘤區(qū)域具有區(qū)別于正常組織的特殊微環(huán)境,如pH值偏低等特點.基于此,近年來,各種pH敏感型的藥物載體被合成出來用于抗癌藥物的傳遞,20,21這些材料不僅可以實現(xiàn)在腫瘤部位的智能釋藥,而且可以有效降低藥物的毒副作用,提高抗腫瘤效果.然而,這些載體材料大多是一些嵌段高聚物,其制備方法復雜,形成的納米組裝體粒徑較大,生物相容性差.因此,鑒于腫瘤組織的酸性微環(huán)境特征和多肽自身良好的生物相容性,AP1多肽組裝體有望成為新的、理想的pH敏感型載體材料,用于抗癌藥物的智能傳遞.

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Self-Assembly and Acid-Responsive Behavior of Three Amphiphilic Peptides

LIANG Ju1,*LAI Dan-Yu1WU Wen-Lan2LI Guo-Zhi1LI Jun-Bo1FANG Cai-Lin1
(1Chemical Engineering and Pharmaceutics School,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023, Henan Province,P.R.China;2Medical School,Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023,Henan Province,P.R.China)

Three amphiphilic peptides containing KKGRGDS as hydrophilic heads and VVVVVV,C12,and FAFAFAas hydrophobic tails(VVVVVVKKGRGDS(AP1),C12KKGRGDS(AP2),FAFAFAKKGRGDS(AP3))were designed and prepared using the standard solid-phase peptide synthesis(SPPS)technique.Three peptides assembled into spherical micelles under neutral conditions(pH 7.0)with a size of～30 nm determined by transmission electron microscope(TEM).Dynamic light scattering(DLS)tests showed that their size distributions were uniform and narrow.In dilute hydrochloric acid(pH 5.0),peptideAP1 presented a sharp aciddependent demicellization transition,with no assembled particles found by TEM and no DLS peak in the range 1-1000 nm.However,the micellar structures of the amphiphilic peptidesAP2 andAP3 did not disappear at pH 5.0.TEM results showed that AP2 assembly appeared through aggregation and the shape of AP3 micellar particles became non-spherical or irregular.AP2 assembly at pH 5.0 showed a multiple peak distribution and AP3 assembly showed a broad peak distribution in DLS,consistent with the TEM results.The changes insecondary structures of amphiphilic peptidesAP1,AP2,andAP3 at pH 7.0 and 5.0 were confirmed by circular dichroism(CD)and Fourier transform infrared(FT-IR)spectroscopy.We then selected curcumin as a model drug to investigate the drug-loading capacity and in vitro release behavior of peptideAP1 micelles.As a result, AP1 is expected to comprise an ideal acid-responsive drug carrier for the intelligent delivery of anticancer drugs. The differences betweenAP1,AP2,andAP3 assembly behaviors in neutral and acidic conditions provide a novel and effective approach for regulating self-assembly of peptides.AP1 is expected to offer an ideal pH-responsive functional material.?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

Self-assembly;Nano-sized micelle;Acid-sensitive material;Circular dichroism; Fourier transform infrared spectroscopy;Secondary structure of peptide

O648

10.3866/PKU.WHXB201503031www.whxb.pku.edu.cn

Received:October 16,2014;Revised:March 2,2015;Published on Web:March 3,2015.

?Corresponding author.Email:liangju@haust.edu.cn:Tel:+86-379-64231914.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(51403055).

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