黃天山，王曉清，羅嘉琪，王淑美，孟江，于江泳，梁生旺

橘核質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化研究

黃天山1，王曉清2，羅嘉琪1，王淑美1，孟江1，于江泳3，梁生旺1

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室/廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；2.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，河南鄭州450000；3.國(guó)家藥典委員會(huì)，北京100050)

目的完善橘核藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用2010年版《中國(guó)藥典》中方法對(duì)橘核藥材中的水分、灰分及浸出物進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)薄層鑒別的條件及指標(biāo)成分的高效液相色譜測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果測(cè)定橘核藥材中水分不得超過(guò)7.0%，總灰分不得超過(guò)5.0%，95%乙醇熱浸出物不得少于34.0%，橘核檸檬苦素質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.49%、諾米林質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.46%；薄層鑒別斑點(diǎn)清晰，易于識(shí)別。結(jié)論橘核藥材的水分、灰分、浸出物、薄層鑒別、指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)研究可為橘核藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂、提高提供方法與依據(jù)。

橘核；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層鑒別；高相液相色譜法

橘核為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子[1]356，始載于五代時(shí)期著名的本草書(shū)《日華子本草》[2]，能“治腰痛，膀胱氣，腎疼”?，F(xiàn)代研究表明，橘核具有的鎮(zhèn)痛消炎、抗腫瘤作用，以及對(duì)睪丸腫痛、乳癰腫痛的治療與古籍記載基本吻合[3-6]。

近年來(lái)，有關(guān)橘核及其炮制品化學(xué)成分、藥理作用的研究報(bào)道很多[7-12]，但關(guān)于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究卻很少，2010年版《中國(guó)藥典》也僅對(duì)橘核的來(lái)源、性狀、顯微及其炮制方法進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定，不能滿足全面控制橘核藥材質(zhì)量的要求。為進(jìn)一步提高橘核的質(zhì)量控制水平，規(guī)范其質(zhì)量，本試驗(yàn)在現(xiàn)行版藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)12批不同產(chǎn)地橘核從薄層鑒別、水分、灰分、浸出物、質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定等5方面進(jìn)行了研究，并建立了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；Luna 5 μm C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-500E超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius AG十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；雙槽薄層層析缸(10 cm×10 cm，10 cm× 20 cm)；2F-20D暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；定量毛細(xì)管(美國(guó)Drummond公司)；玻璃薄層板(5 cm×10 cm，10 cm×20 cm)；GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SX2-4-10型高溫箱形電爐(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；坩堝鉗，坩堝。

流動(dòng)相用乙腈、甲醇均為歐普森色譜純，水為超純水；其他試劑石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、H3PO4均為分析純。

檸檬苦素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):800-200102)；諾米林對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):130118002)；食鹽(中鹽長(zhǎng)江鹽化有限公司，批號(hào):20130806XG)。橘核藥材分別購(gòu)于廣州市清平藥材市場(chǎng)、廣東普寧藥材市場(chǎng)、廣州致信藥業(yè)有限公司等，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院李書(shū)淵教授鑒定為蕓香科植物Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子。具體來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 12批橘核藥材的來(lái)源Table 1 Source of 12 batches of C.reticulata

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

分別取12批藥材細(xì)粉，各1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入石油醚20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)。濾渣揮干石油醚，加入二氯甲烷20 mL，超聲 30 min，濾過(guò)。濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另稱取對(duì)照品檸檬苦素、諾米林各適量，分別加甲醇配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的檸檬苦素對(duì)照品溶液、諾米林對(duì)照品溶液，即得。按照薄層色譜法[1]附錄34-35試驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比4∶1)為展開(kāi)劑，在室內(nèi)環(huán)境條件下展開(kāi)。取出，晾干，噴以二甲氨基卞亞基羅丹寧∶硫酸∶乙醇(體積比1∶2∶97)顯色劑，在105℃加熱5 min至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 12批橘核藥材的薄層色譜圖Figure 1 TLC chromatogram of C.reticulata

2.2 水分的測(cè)定

由于橘核不含揮發(fā)油成分，故其水分測(cè)定采用2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄Ⅺ-H中的第一法，即烘干法[1]附錄52-53。取供試品2 g，平鋪于干燥至恒定質(zhì)量的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開(kāi)瓶蓋在105℃烘箱干燥5 h。將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻，稱定質(zhì)量，至連續(xù)2次稱定質(zhì)量的差異不超過(guò)5 mg為止。根據(jù)損失的質(zhì)量，計(jì)算供試品中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

12批橘核水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.72%、5.94%、6.48%、5.85%、5.67%、5.70%、5.49%、6.08%、5.88%、5.65%、6.07%、5.79%，其平均值為5.78%，將橘核水分限量暫定為不得超過(guò)7.0%。

2.3 灰分測(cè)定[1]附錄53

2.3.1 總灰分測(cè)定法 取供試品(過(guò)2號(hào)篩)4.0 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質(zhì)量(準(zhǔn)確至0.01 g)，緩緩熾熱(注意避免燃燒)，至完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至600℃，使完全灰化并至恒定質(zhì)量。根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算供試品中總灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。12批樣品的測(cè)定結(jié)果分別是 3.97%、3.91%、3.93%、3.60%、3.78%、3.60%、3.62%、3.98%、4.01%、3.72%、3.94%、3.85%，其總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為3.83%，將橘核總灰分限量暫定為不得超過(guò)5.0%。2.3.2 酸不溶性灰分測(cè)定法 取“2.3.1”項(xiàng)所得的灰分，在坩堝中小心加入稀HCl約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液并入坩堝中，用無(wú)灰濾紙濾過(guò)，坩堝內(nèi)的殘?jiān)盟从跒V紙上，洗滌液用AgNO3溶液檢測(cè)，至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒定質(zhì)量。根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算供試品中酸不溶性灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。12批樣品的測(cè)定結(jié)果分別是0.018 6%、0.085 6%、0.047 0%、0.086 9%、0.022 8%、0.049 0%、0.045 7%、0.051 1%、0.071 4%、0.011 1%、0.031 6%、0.076 1%，平均值為0.049 7%。從以上數(shù)據(jù)可以看出，12批橘核中酸不溶性灰分極低，故暫定不測(cè)酸不溶性灰分。

2.4 浸出物的測(cè)定[1]附錄62

采用熱浸法測(cè)定。取供試品約4 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加入95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇100 mL，塞緊，稱定質(zhì)量。靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，塞緊，再稱定質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)。精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中。在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。12批樣品的測(cè)定結(jié)果分別是 46.39%、45.22%、39.66%、39.45%、41.88%、41.73%、42.94%、43.33%、43.88%、42.12%、40.89%、42.61%，其平均值為42.51%，將橘核醇溶性浸出物限量暫定為不得低于34.0%。

2.5 檸檬苦素、諾米林的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定[13]

2.5.1 色譜條件 色譜柱為L(zhǎng)una 5 μm C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(體積比62∶38)；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。分別精密吸取混合對(duì)照品、供試品溶液10 μL，按上述條件進(jìn)樣測(cè)定，檸檬苦素、諾米林的保留時(shí)間分別為5.526、6.698 min，理論塔板數(shù)分別為5 854.130、7 186.004。結(jié)果見(jiàn)圖2～圖3。

圖2 檸檬苦素、諾米林對(duì)照品溶液的HPLC圖Figure 2 HPLC Chromatogram of limonin and nomilin reference substances

圖3 橘核藥材的HPLC圖Figure 3 HPLC chromatogram of C.reticulata

2.5.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取檸檬苦素、諾米林對(duì)照品9.70、9.80 mg，分別置于10 mL量瓶中，用色譜級(jí)甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別精密吸取上述2種對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得檸檬苦素、諾米林質(zhì)量濃度分別為0.194、0.196 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取橘核粉末(過(guò)3號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加30 mL石油醚(60～90℃)于70℃水浴回流脫脂4 h，濾過(guò)。殘?jiān)鼡]干石油醚，加入二氯甲烷50 mL 于50℃水浴回流提取1 h，濾過(guò)，濾液置于蒸發(fā)皿中揮干，加色譜級(jí)甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系的考察 分別取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，分別精密吸取2、5、7、10、12、14、16、20 μL，分別按“2.5.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)分別作線性回歸，得回歸方程Y＝7.000 80×105X －6.028 6×103，r＝0.999 7和Y＝7.022 51×105X－3.292 9×103，r＝0.999 7。結(jié)果表明檸檬苦素在0.388～3.88 μg范圍內(nèi)，諾米林在0.392～3.92 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，分別按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄檸檬苦素、諾米林的峰面積。計(jì)算得檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為0.56%、0.25%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取橘核藥材粉末(第4批)約0.5 g，精密稱定，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，分別按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄檸檬苦素、諾米林的峰面積。計(jì)算得檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為0.56%、1.97%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批(第4批)橘核藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.5.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，分別按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄檸檬苦素、諾米林的峰面積。計(jì)算得檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為1.87%、2.94%。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取檸檬苦素、諾米林對(duì)照品適量，加甲醇制成檸檬苦素、諾米林質(zhì)量濃度分別0.453 3、0.483 3 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的橘核粉末0.25 g，共6份，精密稱定。分別精密加入上述混合對(duì)照品溶液3 mL，分別按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果測(cè)得檸檬苦素的平均回收率為99.91%，RSD為1.47%；諾米林的平均回收率為100.86%，RSD為1.25%。見(jiàn)表2。

2.5.9 樣品的測(cè)定 分別取12批橘核藥材，分別按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每批樣品平行操作2份，采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，以干燥品計(jì)算，檸檬苦素和諾米林的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 橘核中檸檬苦素、諾米林的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery results of limonin and nomilin of C.reticulate (n＝6)

表3 12批橘核中檸檬苦素、諾米林的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以干燥品計(jì))Table 3 Contents of limonin and nomilin of 12 batches of C.

由表3可知，橘核藥材干燥品中檸檬苦素和諾米林質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為0.622%和0.586%，故暫規(guī)定橘核中檸檬苦素質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度標(biāo)準(zhǔn)為不得少于0.49%、諾米林質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度標(biāo)準(zhǔn)為不得少于0.46%。

3 討論

本研究考察了不同種類(lèi)及比例的展開(kāi)劑[環(huán)己烷-乙酸乙酯(體積比1∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯(體積比1∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(體積比4∶1∶5)、二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比7∶4)、二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比4∶1)]、不同點(diǎn)樣量、薄層板(自制硅膠H板、自制硅膠G板、硅膠G預(yù)制板)及不同溫度濕度的分離效果，結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好。

2010年版《中國(guó)藥典》收錄的水分測(cè)定方法有甲苯法、烘干法、減壓干燥法及氣相色譜法。由于橘核中不含揮發(fā)油，故本試驗(yàn)采用了烘干法。橘核是種子類(lèi)藥材，藥材本身比較干凈，但在采收和運(yùn)輸過(guò)程中可能引入泥土、砂石，故需要測(cè)定總灰分。浸出物測(cè)定中，分別以H2O、體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%、95%乙醇為浸出溶劑，并以冷浸法、熱浸法為浸出條件進(jìn)行試驗(yàn)，比較試驗(yàn)結(jié)果，最后確定橘核浸出物測(cè)定所用方法為熱浸法，浸出溶劑為95%乙醇。

橘核在1963年版《中國(guó)藥典》首次被收載，此后歷版藥典均有收載，但關(guān)于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，直至2010年版《中國(guó)藥典》也僅有來(lái)源、【性狀】、【鑒別】(僅有橫切面顯微鑒別)描述，鹽橘核僅有【炮制】的描述，并未收載橘核中有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定[1]356。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定橘核藥材中檸檬苦素和諾米林2個(gè)指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可作為橘核質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法之一。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

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(責(zé)任編輯:劉曉涵)

Optimization of Quality standard of Citrus reticulata Blanco Semen

HUANG Tianshan1，WANG Xiaoqing2，LUO Jiaqi1，WANG Shumei1，MENG Jiang1，YU Jiangyong3，LIANG Shengwang1

[1.School of Chinese Materia Medica/Key Laboratory of Digital Quality Evaluation Technique of Traditional Chinese Medicine(TCM)/State Administration of TCM/Guangdong Academies TCM Quality Engineering Technology Research Center，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou Shuqing Medical College，Zhengzhou 450000，China；3.Chinese Pharmacopoeia Commission，Beijing 100050，China]

ObjectiveTo optimize the quality standard and establish an HPLC fingerprint of Citrus reticulata Blanco Semen.MethodsThe moisture，ashes，and ethanol extracts of C.reticulata Blanco Semen were determined according to the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition，and the conditions of the TLC identification and HPLC were optimized.ResultsThe moisture in C.reticulata Blanco Semen was less than 7.0%，with the total ash within 5.0%.The 95%ethanol extract was not less than 34.0%by hot soak，and the contents of index components of limonin and nomilin were not less than 0.49%and 0.46%，respectively. The TLC identification spots were clear and easy to identify.ConclusionThe results might be used as important indicators for the quality standards of the C.reticulata Blanco Semen.

Citrus reticulata Blanco Semen；quality standard；TLC；HPLC

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.011

1006-8783(2015)05-0607-05

2015-07-08

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201207004-7)

黃天山(1988—)，2013級(jí)碩士研究生，Email:164973531＠qq.com；通信作者:梁生旺(1954—)，教授，從事中藥質(zhì)量控制研究，電話:020-39352172，Email:swliang371＠163.com。

時(shí)間:2015-09-30 15:33

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150930.1533.006.html