汪靖超， 滕守振， 陳秀鵬， 杜桂彩， 郭群群， 李榮貴

（青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071）

玉米黃素糖基化酶在大腸桿菌中的表達(dá)與純化

汪靖超， 滕守振， 陳秀鵬， 杜桂彩， 郭群群， 李榮貴

（青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071）

噬夏孢歐文氏菌合成類胡蘿卜素涉及的一系列反應(yīng)都是在相關(guān)酶的催化下完成的，其中催化玉米黃素轉(zhuǎn)化為玉米黃素二葡萄糖苷的玉米黃素糖基化酶由基因crtX編碼。PCR擴(kuò)增出噬夏孢歐文氏菌crtX基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)鎳離子樹脂親和層析、DEAESepharose FF離子交換層析純化，得到了電泳純的重組噬夏孢歐文氏菌玉米黃素糖基化酶，該重組蛋白在體外具有催化玉米黃素轉(zhuǎn)化為玉米黃素二葡萄糖苷的活性。

噬夏孢歐文氏菌；玉米黃素糖基化酶；活性

類胡蘿卜素是一類重要天然色素的總稱，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了750多種天然類胡蘿卜素[1]。類胡蘿卜素包括兩大類：胡蘿卜素類和葉黃素類，所有類胡蘿卜素均為含有40個(gè)碳的類異戊烯聚合物，呈現(xiàn)紅色、橙紅色和黃色等各種顏色。動(dòng)物不能合成類胡蘿卜素，類胡蘿卜素在預(yù)防人體心血管疾病、預(yù)防眼睛疾病、預(yù)防骨質(zhì)疏松、防癌抗癌、抗氧化以及增強(qiáng)免疫力等方面起著非常重要的作用[2-4]。

噬夏孢歐文氏菌（Erwinia uredovora）是一種非光合細(xì)菌，可在菌體中累積類胡蘿卜素——玉米黃素二葡萄糖苷。玉米黃素二葡萄糖苷的合成過程涉及的一系列反應(yīng)，這些反應(yīng)都是在相關(guān)酶的催化下完成的，其中crtX基因編碼玉米黃素糖基化酶（又名：玉米黃素葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶），催化玉米黃素轉(zhuǎn)化為玉米黃素二葡萄糖苷[5]。作者利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，擴(kuò)增出噬夏孢歐文氏菌crtX基因，插入表達(dá)載體pET-15b，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到了可高效表達(dá)重組玉米黃素糖基化酶的工程菌株；經(jīng)鎳離子親和層析、DEAE-Sepharose FF離子交換層析，獲得了電泳純的重組玉米黃素糖基化酶，該酶在體外有轉(zhuǎn)化玉米黃素為玉米黃素二葡萄糖苷的活性。這為我們進(jìn)一步研究E.uredovora玉米黃素糖基化酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理打下了基礎(chǔ)，也為酶法合成玉米黃素二葡萄糖苷的應(yīng)用研究提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Erwinia uredovora菌株：購買自美國模式菌種保 藏 中 心 （American Type Culture Collection，ATCC）；試驗(yàn)所需分子生物學(xué)工具酶：康為世紀(jì)生物科技公司產(chǎn)品；鎳離子螯合樹脂：北京瑞達(dá)恒輝科技公司產(chǎn)品；DEAE-Sepharose Fast Flow：GE Healthcare公司產(chǎn)品；玉米黃素：Chromadex公司產(chǎn)品；玉米黃素二葡萄糖苷：藥名康德公司產(chǎn)品，UDP-葡萄糖：Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平：美國雙杰兄弟有限公司；PCR儀：eppendorf公司；Mini proteinⅡ蛋白質(zhì)電泳儀：Bio-Rad公司；高效液相色譜系統(tǒng) LC-20 AT：島津公司；C18色譜柱：VP-ODS，150 mm×4.6 mm。

1.3 方法

1.3.1 提取E.uredovora基因組總DNA及crtX基因的擴(kuò)增 提取E.uredovora基因組DNA的方法參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。根據(jù)已發(fā)表E.uredovora的crtX基因序列[5]，設(shè)計(jì)出一對(duì)引物：引物1：5’-AAACATATGAGCCATTTGG-3’； 引 物 2：5’-AAACTCGAGTCATAATGCGGTTG-3’。其中，引物1中含有NdeⅠ酶切位點(diǎn)，引物2中含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)。利用該引物PCR擴(kuò)增E.uredovora的crtX基因。

1.3.2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建基因工程菌菌株 擴(kuò)增出的crtX基因首先連入pBS-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含IPTG、X-gal和氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白斑菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒載體pBS-TcrtX。NdeI和XhoI雙酶切鑒定，回收crtX片段，并對(duì)其序列進(jìn)行分析鑒定。

將回收的經(jīng)過序列分析鑒定的crtX基因片段連接到質(zhì)粒載體pET-15b上，考慮到NdeI的酶切效率較低，重組質(zhì)粒載體pET-15bcrtX用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定。鑒定后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。

1.3.3 重組玉米黃素糖基化酶的純化 鎳離子樹脂親和層析的方法參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，合并含目的蛋白的洗脫液，離心濃縮管濃縮，上DEAE-Sepharose FF離子交換層析柱（1.0 cm×8.0 cm），用含0～1 000 mmol/L NaCl的緩沖液 （50 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5，50 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L PMSF）洗脫，流速為1.0 mL/min，對(duì)洗脫液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.3.4 重組玉米黃素糖基化酶的活性測(cè)定 以80 μL純化的玉米黃素糖基化酶酶液，5 μL、2.7 mmol/L的玉米黃素丙酮溶液、15 μL、6.7 mmol/L的UDP-葡萄糖溶液 （50 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5，1 mmol/L巰基乙醇）構(gòu)建反應(yīng)體系，避光反應(yīng)5 h，氯仿/甲醇（體積比為2∶1）抽提，抽提液經(jīng)HPLC分析。C18色譜柱：VP-ODS（SHIMADZU，150×4.6 mm），流動(dòng)相A：甲醇/水（體積比95∶5），流動(dòng)相B：甲醇/四氫呋喃（體積比7∶3）；采用線性洗脫，流動(dòng)相A洗脫5 min，第5～10分鐘流動(dòng)相B從0上升到100%，之后流動(dòng)相B洗脫保持8 min；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬夏孢歐文氏菌crtX基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的完整E.uredovora基因組為模板，PCR擴(kuò)增出了大小約為1 300 bp的DNA片段，與已報(bào)道的crtX基因（1 296 bp）[5]的大小一致，見圖1。

將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體pBS-T上構(gòu)建了pBS-TcrtX，質(zhì)粒pBS-TcrtX用NdeⅠ與XhoⅠ雙酶切后，可切出1 300 bp的目的片段，大小與crtX基因相符。測(cè)序分析也顯示與文獻(xiàn)報(bào)道的噬夏孢歐文氏菌crtX基因序列[5]完全一致。將測(cè)序正確的crtX基因從pBS-TcrtX上切下，插入pET-15b構(gòu)建了pET-15bcrtX。由于pET-15b上NdeI和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)僅相隔97 bp，質(zhì)粒pET-15bcrtX用XbaⅠ與XhoⅠ雙酶切，切出片段的大小與插入的crtX基因大小差別不大。雙酶切結(jié)果見圖1。切下的片段大小約1 300 bp，大小與預(yù)期的一致，說明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒。

圖1 噬夏孢歐文氏菌crtX的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的雙酶切分析Fig.1 PCR amplification of crtX and restriction digestion analysis of recombinant plasmids

2.2 重組蛋白的表達(dá)

噬夏孢歐文氏菌crtX基因的長度為1 296 bp[5]，加上pET-15b質(zhì)粒的His-tag編碼區(qū)，重組蛋白是由451個(gè)氨基酸殘基組成。將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-15bcrtX轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)。細(xì)菌全蛋白的SDS-PAGE分析表明，與空白E.coli BL21（DE3）相比，工程菌菌體中出現(xiàn)了大量相對(duì)分子質(zhì)量約為45 000的重組蛋白，與預(yù)期的重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小吻合，也與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的噬夏孢歐文氏菌玉米黃素糖基化酶的相對(duì)分子質(zhì)量大小相符，說明噬夏孢歐文氏菌crtX基因在大腸桿菌菌體內(nèi)得到了高效表達(dá)，見圖2。

2.3 重組蛋白的純化

工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、超聲波細(xì)胞破碎、高速離心后，上清液中的可溶性重組玉米黃素糖基化酶經(jīng)鎳離子樹脂親和層析和DEAE-Sepharose FF離子交換層析得到了純化，純化后的重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量在45 000左右。

圖2 重組玉米黃素糖基化酶在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.2 Overexpression of zeaxanthin glycosylase in Escherichia coli

2.4 重組蛋白的活性測(cè)定

圖3—4分別為玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品和玉米黃素二葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以純化的重組蛋白和玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品、UDP-葡萄糖構(gòu)建反應(yīng)體系，避光反應(yīng)5 h，氯仿/甲醇抽提液經(jīng)HPLC分析，結(jié)果見圖5。參照標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，圖5中吸收峰3為未反應(yīng)的底物玉米黃素，吸收峰1為反應(yīng)產(chǎn)物玉米黃素二葡萄糖苷。吸收峰2位于吸收峰3和吸收峰1之間，由于目前沒有玉米黃素一葡萄糖苷商品化標(biāo)準(zhǔn)品的出售，我們推測(cè)吸收峰2應(yīng)該是反應(yīng)的中間產(chǎn)物玉米黃素一葡萄糖苷。這證明純化的重組蛋白是有活性的，在體外可催化玉米黃素轉(zhuǎn)化為玉米黃素二葡萄糖苷。以反應(yīng)底物玉米黃素的消耗量計(jì)算，重組玉米黃素糖基化酶的酶活力為0.87 μg/h。

圖3 玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of zeaxanthin standards

圖4 玉米黃素二葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of zeaxanthin diglucoside standards

圖5 重組玉米黃素糖基化酶催化玉米黃素反應(yīng)的HPLC分析Fig.5 Zeaxanthin diglucoside assay by HPLC analysis

3 結(jié)語

噬夏孢歐文氏菌在細(xì)胞中累積玉米黃素二葡萄糖苷，所以菌體呈黃色。玉米黃素二葡萄糖苷通過異戊二烯化合物和萜類化合物途徑合成，Misawa等[5]對(duì)噬夏孢歐文氏菌玉米黃素二葡萄糖苷合成的過程以及催化相關(guān)反應(yīng)的酶類及其編碼基因進(jìn)行了分析：類胡蘿卜素合成的前體物質(zhì)法尼基焦磷酸（FPP）、異戊烯焦磷酸 （IPP）在基因crtE編碼的GGPP合成酶催化下合成牻牛兒基牻牛兒焦磷酸（GGPP）；牻牛兒基牻牛兒焦磷酸在基因crtB編碼的八氫番茄紅素合成酶的催化下形成無色的八氫番茄紅素，八氫番茄紅素是整個(gè)合成途徑中的第一個(gè)類胡蘿卜素分子；八氫番茄紅素在基因crtI編碼的八氫番茄紅素脫氫酶作用下形成番茄紅素；番茄紅素在基因crtY編碼的番茄紅素環(huán)化酶的催化下形成β-胡蘿卜素；然后β-胡蘿卜素在基因crtZ編碼的β-胡蘿卜素脫氫酶作用下形成玉米黃素；玉米黃素在基因crtX編碼的玉米黃素糖基化酶催化下最終形成玉米黃素二葡萄糖苷。汪靖超等[6-8]分別PCR擴(kuò)增出噬夏孢歐文氏菌crtE、crtB、crtY等基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化，獲得了相應(yīng)的噬夏孢歐文氏菌GGPP合成酶、八氫番茄紅素合成酶以及番茄紅素環(huán)化酶等重組蛋白。Seo等[9]將Paracoccus haeundaensis的crtX基因?qū)胭|(zhì)粒pSTV29，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTCRT-X，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化已含有質(zhì)粒pET-44a（+）-CrtEBIYZ的大腸桿菌E.coli BL21（DE3），得到了含有合成玉米黃素二葡萄糖苷所需全部基因：CrtE、CrtB、CrtI、CrtY、CrtZ和CrtX的大腸桿菌菌株，該大腸桿菌可在菌體細(xì)胞中累積玉米黃素二葡萄糖苷。

疏水性的類胡蘿卜素與活性的糖分子縮合，可使類胡蘿卜素分子極性增強(qiáng)，疏水性降低。玉米黃素二葡萄糖苷是已知的自然界中極性最強(qiáng)的一種類胡蘿卜素，其水溶性比玉米黃素高63倍[10]。通過合成玉米黃素二葡萄糖苷，可使植物和細(xì)菌細(xì)胞免受過剩光能和活性氧造成的光氧化損害以及穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用[11-12]。但玉米黃素二葡萄糖苷在自然界的含量很低，屬稀有類胡蘿卜素，對(duì)其相關(guān)性質(zhì)的研究也非常少，玉米黃素是人眼睛視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的主要色素，對(duì)眼睛的健康[13-14]、以及抑制腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫力等有很重要的作用[15]。但我們對(duì)玉米黃素二葡萄糖苷對(duì)人體或動(dòng)物的健康的作用卻知之甚少。利用基因工程技術(shù)，使大腸桿菌產(chǎn)生重組玉米黃素糖基化酶，就可以人工大量合成玉米黃素二葡萄糖苷這種自然界中的稀有類胡蘿卜素，這將為其性質(zhì)的研究創(chuàng)造了充分的條件。

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Expression and Purification of Zeaxanthin Glycosylase in E.coli

WANG Jingchao， TENG Shouzhen， CHEN Xiupeng， DU Guicai， GUO Qunqun， LI Ronggui
（College of Life Sciences，Qingdao University，Qingdao 266071，China）

Several carotenoids are synthesized by related enzymes in Erwinia uredovora，. Zeaxanthin diglucoside is synthesized by zeaxanthin glycosylase which was encoded by gene crtX.In this study，crtX of E.uredovora was amplified by PCR and cloned into expression vector.The recombinant plasmid was then transformed into E.coli BL21 （DE3）to construct the engineering bacterium.The recombinant zeaxanthin glycosylase was purified by Ni2+chelating affinity chromatography and a DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatography.The purified protein catalyze the formation of zeaxanthin diglucoside in vitro.

Erwinia uredovora，zeaxanthin glycosylase，activity

Q 785；Q 786

A

1673—1689（2015）08—0886—05

2014-06-16

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2008D25）。

汪靖超（1973—），男，山東青島人，理學(xué)碩士，講師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。E-mail：wangjc@qdu.edu.cn