寧 崇， 鄭 艷， 趙素潔， 孫宇強

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110086）

土生拉烏爾菌Y20產(chǎn)乳糖氧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化

寧 崇， 鄭 艷*， 趙素潔， 孫宇強

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110086）

以選育的土生拉烏爾菌（Y20）為生產(chǎn)菌株，在單因素和響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)上考察了不同發(fā)酵條件對乳糖氧化酶活性的影響。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵條件對乳糖氧化酶活性影響次序：初始pH＞發(fā)酵時間＞接種體積分?jǐn)?shù)＞發(fā)酵溫度。響應(yīng)面分析優(yōu)化的最適發(fā)酵條件：發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度28℃，初始pH 7.2，接種體積分?jǐn)?shù)2%。最優(yōu)發(fā)酵條件下乳糖氧化酶的實際酶活可達(dá)78.36 U/g，與預(yù)測的酶活78.85 U/g接近。

土生拉烏爾菌Y20；乳糖氧化酶；響應(yīng)面分析；優(yōu)化

乳糖酸是一種新型的多羥基有機酸[1]，因其具有多種生理功能而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工行業(yè)[2-3]。目前，歐美等國家乳糖酸的生產(chǎn)主要采用化學(xué)合成法[4]。但該方法在氧化過程中伴有多種副產(chǎn)物的生成，致使產(chǎn)品分離純化比較困難，生產(chǎn)成本相對較高，因此乳糖酸一直未能成為大眾的化工商品，限制了其應(yīng)用范圍。酶法生產(chǎn)乳糖酸始于1998年，主要采用兩步法。所用酶主要有纖維二糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖果糖氧化還原酶等，該法由于所用酶的底物專一性、穩(wěn)定性等原因始終難以和化學(xué)合成法抗衡。

2001年Xu等發(fā)現(xiàn)的一種新的碳水化合物氧化酶——乳糖氧化酶[5]，該酶對乳糖氧化為乳糖酸具有較高的特異性[6]。乳糖氧化酶可以將單糖、二糖、多糖氧化，并將電子直接傳遞給氧氣，生成過氧化氫，再通過催化反應(yīng)將過氧化氫還原為水[7]，在食品中是安全的。這種酶含有FAD，與已經(jīng)報道的葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶或吡喃糖氧化酶不同，對寡聚糖和長碳鏈的聚合糖類有很高的活性，乳糖氧化酶對乳糖的親和性也很高[8]。

以選育的土生拉烏爾菌（Y20）為出發(fā)菌株，通過單因素及響應(yīng)面分析設(shè)計試驗對乳糖氧化酶的發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究[9-11]，以期為該酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 土生拉烏爾菌 Raoultella terrigena（Y20）：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)實驗室選育。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 固體培養(yǎng)基：乳糖 10 g、蛋白胨10 g、NH4NO32 g、NaCl 2 g、KH2PO41 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL；pH 7.2～7.4。

液體培養(yǎng)基：同固體培養(yǎng)基，不加瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將土生拉烏爾菌（Y20）在固體培養(yǎng)基上活化后，接種于液體培養(yǎng)基中，于28℃下培養(yǎng)24 h[12]。

1.2.2 發(fā)酵條件對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響

1）發(fā)酵時間對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%接種體積分?jǐn)?shù)接種在乳糖氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件相同的情況下培養(yǎng)12、24、36、48、60 h，測定其酶活性。

2）發(fā)酵溫度對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種在乳糖氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在其他條件相同的情況下于24、26、28、30、32℃培養(yǎng)24 h，測定其酶活性。

3）起始pH值對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種在產(chǎn)乳糖氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件相同的情況下分別調(diào)節(jié)pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，培養(yǎng)24 h，測定酶活性。

4）接種體積分?jǐn)?shù)對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響：將菌株以1%、2%、3%、4%、5%的不同接種體積分?jǐn)?shù)接種于產(chǎn)乳糖氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基，在其他條件相同的情況下，測定其酶活性。

1.2.3 分析方法

1）乳糖氧化酶活性的測定：乳糖氧化酶可以氧化乳糖為乳糖酸，乳糖酸在酸性條件下可分解為葡萄糖酸和半乳糖，葡萄糖酸在酸性條件下發(fā)生內(nèi)酯化，形成的內(nèi)酯與羥胺堿反應(yīng)，生成異羥肟酸。異羥肟酸與FeCl3能生成有色絡(luò)合物，從而可通過分光光度法定量分析葡萄糖酸的含量[13]。乳糖氧化酶活性由D-葡萄糖酸的量來檢驗，一個酶活單位定義為：每分鐘細(xì)胞產(chǎn)生1 μmol葡萄糖酸的量。

含0.4 mol/L的乳糖、0.2 mol/L磷酸氫二鈉、0.1 mol/L、pH 6.0的檸檬酸緩沖液0.5 mL及細(xì)胞懸液0.5 mL的混合液1.0 mL，在40℃下反應(yīng)10 min后，加入50 μL、1 mol/L NaOH以終止反應(yīng)。向混合物中加入50 μL、1mol/L HCl，中和NaOH。反應(yīng)混合物加0.5mL、2 mol/L HCl，煮沸40 min，以水解乳糖酸為D-葡萄糖酸和D-半乳糖。在10 mL具塞試管中加入0.5 mL待測樣，再加入0.5 mL去離子水，混合均勻后，沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫。然后順序加入2 mL鹽酸羥胺和NaOH混合試劑、1 mL、4 mol/L HCl和1 mL FeCl3試劑，混合均勻，這時反應(yīng)混合物的pH為1.2±0.2。放置10 min后比色（波長505 nm），以空白管（用0.5 mL去離子水替代樣品溶液，其余試劑用量與前相同）校零，讀取各管的吸光度OD505值，測定工作在10 min內(nèi)完成[14]。

2）蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定：采用紫外分光光度法，以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品做蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。將牛血清蛋白配置成質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25 mg/mL的溶液，在280 nm處測定吸光度值。以牛血清蛋白的質(zhì)量濃度c為橫坐標(biāo)，280 nm處的吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。A=0.909 9c+0.005 2。相關(guān)系數(shù)：R=0.999 2。其中，A為牛血清蛋白在280 nm處的吸光度值；c為牛血清蛋白的質(zhì)量濃度。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Bovine serum protein standard curve

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響

2.1.1 發(fā)酵時間對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響 改變發(fā)酵培養(yǎng)條件中的發(fā)酵時間，其他條件不變，考察發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響，結(jié)果見圖2。在發(fā)酵12～24 h時，隨著時間的推移，酶活逐漸增長；在發(fā)酵24～60 h時，隨著時間的推移，酶活性緩慢降低；在發(fā)酵24 h時達(dá)到峰值，乳糖氧化酶活性為70.24 U/g。

圖2 發(fā)酵時間對產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響Fig.2 Effect of fermentation time on lactose oxidase

2.1.2 發(fā)酵溫度對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響 改變發(fā)酵培養(yǎng)條件中的發(fā)酵溫度，其他條件不變，考察發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響，結(jié)果見圖3。發(fā)酵溫度在24～28℃時，隨著溫度的提高，酶活逐漸升高；發(fā)酵溫度在28～32℃時，隨著溫度的提高，酶活逐漸降低；在發(fā)酵溫度28℃時達(dá)到峰值，酶活為73.19 U/g。

2.1.3 起始pH值對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響 酸堿度對微生物的生長代謝有著重要影響，不同的微生物對酸堿有不同的適應(yīng)性。確定了發(fā)酵液初始pH之后，在整個發(fā)酵過程中不再人為改變發(fā)酵液pH值的情況下，考察發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH的變化對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響。

圖3 發(fā)酵溫度對產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響Fig.3 Impact of fermentation temperature on lactose oxidase

不同的初始pH值不僅可以影響營養(yǎng)物質(zhì)的可給性，同時也會影響代謝過程中酶的催化活性，進(jìn)而影響到乳糖氧化酶活性。作者以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵24 h，測定乳糖氧化酶活性。由圖4可知，在發(fā)酵液初始pH值為7.0時，乳糖氧化酶活性最高，因此確定該菌株的發(fā)酵初始pH值為7.0。

圖4 起始pH對產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響Fig.4 Effect of beginning of pH valve on lactose oxidase

2.1.4 接種體積分?jǐn)?shù)對菌株（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響 接種體積分?jǐn)?shù)的大小直接影響乳糖氧化酶活性，合適的接種體積分?jǐn)?shù)不僅可以提高產(chǎn)物的合成速率，也有利于減少染菌機會。改變發(fā)酵培養(yǎng)條件中的接種體積分?jǐn)?shù)，其他條件不變，考察接種體積分?jǐn)?shù)對菌株產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響，結(jié)果見圖5。接種體積分?jǐn)?shù)為2%時，發(fā)酵液中乳糖氧化酶活性最高；隨著接種體積分?jǐn)?shù)的增加，乳糖氧化酶活性開始下降，這主要是由于過高的接種體積分?jǐn)?shù)使得菌體細(xì)胞的數(shù)量增殖過快，營養(yǎng)消耗過多，進(jìn)而影響到代謝產(chǎn)物的生成量。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化土生拉烏爾菌（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶的發(fā)酵條件

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 為優(yōu)化土生拉烏爾菌（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶發(fā)酵條件，采用經(jīng)典的四因素三水平Box-Behnken試驗設(shè)計[15]，在單因素試驗基礎(chǔ)上，對發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始pH（C）、接種量（D）進(jìn)行優(yōu)化，具體方案及結(jié)果見表1-2。

圖5 接種體積分?jǐn)?shù)對產(chǎn)乳糖氧化酶能力的影響Fig.5 Impact of amount of inoculation on lactose oxidase

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 Box-Behnken Design實驗設(shè)計與實驗響應(yīng)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and response result values

續(xù)表2

2.2.2 模型評價 利用Design-Exper7.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式逐步回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為：

Y=75.66+2.16A+1.73B+2.44C-2.08D+0.38AB-0.01AC+0.11AD-0.54BC-0.03BD-0.34CD-11.48A2-12.01B2-18.59C2-7.82D2

模型方差分析結(jié)果和各項系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果列于表3。

從表3可以看出，土生拉烏爾菌產(chǎn)乳糖氧化酶活性影響的大小順序為：初始pH＞發(fā)酵時間＞接種體積分?jǐn)?shù)＞發(fā)酵溫度。

模型中的F=4 931.83，P＜0.05，說明本實驗采取的二次模型是極顯著的。PA、PB、PC、PAB、PBC、PCD、PA2、PB2、PC2、PD2均小于0.05，說明取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH及其4個因素的二次項都具有顯著的影響。決定因素R2=0.999 8，也說明模型能夠很好地反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好。

根據(jù)回歸方程，用Design-Expert7.0軟件做出響應(yīng)面，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀。通過Design-Expert7.0軟件優(yōu)化功能再次優(yōu)化，結(jié)果見圖6—11。分別顯示了發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間與初始pH、發(fā)酵時間與接種體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度與初始pH、發(fā)酵溫度與接種體積分?jǐn)?shù)、初始pH與接種體積分?jǐn)?shù)之間的相互作用對乳糖氧化酶活性的影響。

圖6 Y=f（A，B）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Respond figic and contour plot for Y=f（A，B）

圖7 Y=f（A，C）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Respond figic and contour plot for Y=f（A，C）

圖8 Y=f（A，D）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Respond figic and contour plot for Y=f（A，D）

圖9 Y=f（B，C）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Respond figic and contour plot for Y=f（B，C）

圖10 Y=f（B，D）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Respond figic and contour plot for Y=f（B，D）

圖11 Y=f（C，D）的響應(yīng)面和等高線圖Fig.11 Respond figic and contour plot for Y=f（C，D）

由圖6—11可以直觀地看出各因素對響應(yīng)值的影響及其變化趨勢，可以找出最佳參數(shù)。在所選的范圍內(nèi)存在極值，而且回歸模型確實存在最大值。乳糖氧化酶活性隨著考察因素的逐漸增大而升高；當(dāng)繼續(xù)增加超過實驗取得的各因素的中心值時，乳糖氧化酶活性隨著考察因素的增加而降低。圖6說明，發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度、發(fā)酵溫度與初始pH、初始pH與接種體積分?jǐn)?shù)之間有顯著影響；發(fā)酵時間與初始pH、發(fā)酵時間與接種體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度與接種體積分?jǐn)?shù)之間影響不夠顯著，正如方差結(jié)果所示。

通過最優(yōu)化分析，最佳的發(fā)酵時間為24.93 h，最佳發(fā)酵溫度為28.13℃，最適初始pH為7.16，最佳接種體積分?jǐn)?shù)1.88%，預(yù)測乳糖氧化酶活性為78.36 U/g。但考慮實際操作的局限性，設(shè)定發(fā)酵時間為25 h，發(fā)酵溫度28℃，初始pH為7.2，接種體積分?jǐn)?shù)為2%。

2.2.3 驗證響應(yīng)面優(yōu)化土生拉烏爾菌（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶最佳發(fā)酵條件 在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行乳糖氧化酶發(fā)酵驗證實驗，實際酶活為78.36 U/g，與預(yù)測的酶活78.85 U/g接近。

3 結(jié)語

酶法生產(chǎn)乳糖酸始于1998年，乳糖在纖維二糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖果糖氧化還原酶等酶的催化下，通過二步法轉(zhuǎn)化為乳糖酸。此法由于所用酶的底物專一性、穩(wěn)定性等原因，始終難以和化學(xué)合成法及電轉(zhuǎn)化法相抗衡。乳糖氧化酶和乳糖脫氫酶是最近幾年來發(fā)現(xiàn)的兩種能夠直接將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸的氧化還原酶類。雖然這兩種酶均具有底物專一性強，轉(zhuǎn)化率高的特點，但是由于乳糖脫氫酶是一種膜結(jié)合蛋白，分離純化過程極其復(fù)雜，且該酶容易失活，因而使其在酶法生產(chǎn)乳糖酸中失去競爭優(yōu)勢。乳糖氧化酶最初是在真菌中發(fā)現(xiàn)的一種以FAD為輔助因子的，能夠?qū)⑷樘侵苯友趸扇樘撬岬囊环N氧化還原酶。該酶對乳糖具有較高的親和性，且穩(wěn)定性較高。關(guān)于產(chǎn)酶的微生物菌種及產(chǎn)酶條件的研究鮮少見報道。

作者考察了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、接種體積分?jǐn)?shù)四個因素對土生拉烏爾菌（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶的影響程度。模型擬合度較好，可對土生拉烏爾菌（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶的影響因素起動態(tài)分析和最優(yōu)結(jié)果預(yù)測的作用。通過Design-Expert7.0軟件優(yōu)化功能確證了本次實驗考察因素的最優(yōu)工藝參數(shù)，即最佳的發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間25 h，發(fā)酵溫度28℃，初始pH 7.2，接種體積分?jǐn)?shù)2%，為土生拉烏爾菌（Y20）產(chǎn)乳糖氧化酶氧化乳糖提供一定的條件。

[1]DHARIWAL A，MAVROV V，SCHROEDE I.Production of lactobionic acid with process integrated electrochemical enzyme regeneration and optimization of process variables using response surface methods（RSM）[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2006，42（1/2）：64-69.

[2]Charloux C，Paul M，Loisance D，et al.，Inhibition of hydroxyl radical production by lactobionate，adenine，and tempol[J].Free Radical Bio Med，1995，19：699-704.

[3]Gerling K G，Wilke D.Washing or detergent composition containing lactobionic acid or lactobionic acid salts[P].US Patent 5069808,1991-12-03.

[4]KUUSISTOA J，TOKAREVA A V，MURZINA E V.From renewable raw materials to high value-added fine chemicals：catalytic hydrogenation and oxidation of D-lactose[J].Catalysis Today，2007，121（1/2）：92-99.

[5]Feng Xu，Elizbeth J Golightly，Claus C Fuglsang，et al.A novel carbohydrate：acceptor oxidoreductase from Microdochium nivale [J].Eur J Biochem，2001，268（4）：1136-1142.

[6]Ahmad S K，Brinch D S，F(xiàn)riis E P，et al.Toxicological studies on lactose oxidase from Microduchium nivale expressed in Fusdrium venenatum[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2004，39（3）：256-270.

[7]Lin S F，Hu H M，Inukai T.Production of novel oligosaccharide oxidase by wheat bran solid-state fermentation[J].Biotechnol Adv，1993，11（3）：417-427.

[8]白會釵，繆銘，江波，等.乳糖酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012（2）：430-436. BAI Huichai，MIAO Ming，JIANG Bo，et al.Review on research progress of lactobionic acid[J].Science and Technology of Food Industry，2012（2）：430-436.（in Chinese）

[9]Zhou X，Zheng Y，Ye H M，et al.Fermentation medium optimization of thermophilic proteinase by response surface methodology [J].Journal of Biomathematics，2007，22（1）：113-118.

[10]Kalil S J，Maugeri F，Rodrigues M I.Response surface analysis and simulation as a tool for bioprocess design and optimization[J]. Process Biochemistry，2000，35（6）：539-550.

[11]Ramkrishna S，Swaminatathan T.Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the effects of inoculum sage and size on surfactin production[J].Biochemical Engineering Journal，2004，21（2）：141-148.

[12]鄭艷，李超.乳糖酸生產(chǎn)菌株的篩選與鑒定[J].食品工業(yè)科技，2012，34（4）：189-192. ZHENG Yan，LI Chao.Screening and identifying lactobionic acid producing bacteria strain[J].Science and Technology of Food Industry，2012，34（4）：189-192.（in Chinese）

Optimum Fermentation Condition of Production Lactose Oxidase by Raoultella terrigena Y20

NING Chong， ZHENG Yan*， ZHAO Sujie， SUN Yuqiang
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

The effects of fermentation conditions on lactose oxidase activity producing by Raoultella terrigena Y20，which was screened by our lab，were studied by single factor experiment and response surface methodology.The results showed that the four independent variables as initial pH value，fermentation time，inoculation amount and fermention temperature had significant and sequence effects on the lactose oxidase activity.The optimal fermention conditions were as follows，inoculum amount of 2%，initial pH at 7.2，fermented 25 h，temperature at 28℃.Under the optimal conditions，the lactose oxidase activity was 74.96 U/g，which was almost consistent with predicted value of 78.87 U/g.

Raoultella terrigena Y20，lactose oxidase，response surface methodology，optimum

TQ920.6

A

1673—1689（2015）08—0879—07

2014-04-23

遼寧自然科學(xué)基金項目（201202190）。

*通信作者：鄭 艷（1973—），女，遼寧丹東人，農(nóng)學(xué)博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)、發(fā)酵工程和酶工程方面的研究。E-mail：zhengyan0403@163.com