劉麗華，沈衛(wèi)德，李 兵

(1 通化師范學(xué)院 生物系，吉林 通化 134000；2 蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

辛硫磷對(duì)家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

劉麗華1，沈衛(wèi)德2，李 兵2

(1 通化師范學(xué)院 生物系，吉林 通化 134000；2 蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

【目的】 探討經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后，家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在5齡幼蟲(chóng)各種組織中的轉(zhuǎn)錄活性，為進(jìn)一步研究有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)家蠶的損傷機(jī)制提供參考。【方法】 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以飼喂清水浸泡過(guò)的桑葉為對(duì)照，分析家蠶5齡3 d幼蟲(chóng)喂食辛硫磷(4 μg/mL)浸泡桑葉24 h后，腦、脂肪體、中腸、絲腺、馬氏管、精巢及卵巢等7種組織中4種細(xì)胞周期蛋白家族基因的轉(zhuǎn)錄水平?！窘Y(jié)果】 與對(duì)照組相比，辛硫磷誘導(dǎo)24 h后，CyclinA、CyclinB、CyclinB3在各組織中均表達(dá)上調(diào)，CyclinE在中腸及脂肪體中表達(dá)顯著下調(diào)，在精巢與馬氏管中無(wú)明顯變化，在其他組織中則表達(dá)上調(diào)。【結(jié)論】 辛硫磷誘導(dǎo)24 h后，家蠶組織中CyclinA、CyclinB及CyclinB3基因表達(dá)上調(diào)，這可能是家蠶對(duì)磷脅迫的響應(yīng)；CyclinE在中腸及脂肪體中表達(dá)顯著下調(diào)，這與這2種器官是家蠶重要的解毒代謝器官有關(guān)。

家蠶；辛硫磷 ；細(xì)胞周期蛋白；基因轉(zhuǎn)錄

細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)是一類(lèi)隨著細(xì)胞周期變化而周期性出現(xiàn)和消失的蛋白，具有種屬和組織特異性，其在從酵母到人類(lèi)等真核生物中都具有廣泛的作用。細(xì)胞周期蛋白的共同特點(diǎn)是具有100～150個(gè)氨基酸組成的周期蛋白盒保守序列，細(xì)胞靠此結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(Cyclindependent kinase，CDK)結(jié)合形成活性復(fù)合物，對(duì)細(xì)胞周期的啟動(dòng)及各時(shí)相的轉(zhuǎn)換起關(guān)鍵性調(diào)控作用[1]。細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)具有典型的周期性和時(shí)相特異性，其可作為調(diào)節(jié)亞基與相應(yīng)的CDK形成復(fù)合物，并正調(diào)節(jié)CDK的活性。不同的細(xì)胞周期蛋白在不同時(shí)相可通過(guò)相應(yīng)的CDK起促進(jìn)細(xì)胞完成周期的作用[2]。

目前，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了20多種細(xì)胞周期蛋白家族成員，其中家蠶體內(nèi)報(bào)道了6種，即CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1和CyclinH，這6種都是家蠶細(xì)胞完成細(xì)胞周期必不可少的。通過(guò)RNA干涉技術(shù)下調(diào)家蠶CyclinA基因能有效地抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G1期[3]；CyclinB及 CyclinB3同屬于B型周期蛋白，是家蠶細(xì)胞周期M期的限速因素[4]；CyclinE基因在家蠶細(xì)胞G1/S期起重要作用[5]；CyclinL1基因與家蠶胚胎期滯育及非滯育性卵的發(fā)育調(diào)控相關(guān)[6]；CyclinH在家蠶發(fā)育分化過(guò)程中可能對(duì)其他周期蛋白的表達(dá)有調(diào)控作用[7]。

家蠶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，由于其長(zhǎng)期在室內(nèi)飼養(yǎng)，對(duì)外界不良環(huán)境的抗性較弱，尤其對(duì)農(nóng)藥的抵抗能力更弱[8]，在生產(chǎn)過(guò)程中，常由于農(nóng)藥中毒而造成家蠶大量減產(chǎn)。有機(jī)磷農(nóng)藥是目前我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用較廣泛的農(nóng)藥之一，它主要通過(guò)抑制其靶標(biāo)物乙酰膽堿酯酶的活性而使昆蟲(chóng)中毒死亡[9]。有機(jī)磷對(duì)家蠶的危害，還表現(xiàn)在對(duì)食物消化、生長(zhǎng)、繁殖、氧化應(yīng)激及生理狀態(tài)的影響等方面[10-12]。目前此方面已有研究主要集中在有機(jī)磷農(nóng)藥與家蠶抗性的關(guān)系方面，而關(guān)于有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)家蠶細(xì)胞周期調(diào)控因子的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)辛硫磷農(nóng)藥誘導(dǎo)24 h后，家蠶5齡3 d幼蟲(chóng)各種組織中細(xì)胞周期蛋白家族基因CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE表達(dá)水平的變化，以期為進(jìn)一步研究有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)家蠶的損傷機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng) 供試家蠶品種為大造，由蘇州大學(xué)蠶桑實(shí)驗(yàn)室提供，于(25±1) ℃、濕度60%～75%條件下用桑葉飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 辛硫磷購(gòu)自Sigma公司；總RNA抽提試劑盒Trizol-A、 M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及其他化學(xué)試劑，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)處理 供試家蠶飼養(yǎng)至5齡3 d時(shí)，將桑葉分別浸泡于用丙酮稀釋至4 μg/mL的辛硫磷藥液(其LC50=7.86 μg/mL)[13](即試驗(yàn)組)和清水(即對(duì)照組)中，3 s后取出晾干，分別飼喂家蠶。24 h后分別采集試驗(yàn)組與對(duì)照組家蠶的腦、脂肪體、中腸、絲腺、馬氏管、精巢及卵巢等組織，凍存于液氮中，備用。

1.2.2 家蠶組織總RNA的提取及cDNA的制備 按照Trizol-A 試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法，分別提取試驗(yàn)組與對(duì)照組5齡3 d家蠶幼蟲(chóng)各組織的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的各組織RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA，備用。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用Primer 5.0軟件，按照Real-time PCR要求設(shè)計(jì)Actin3內(nèi)參基因和CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的引物(表1)。以合成的cDNA為模板，采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒對(duì)各基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過(guò)程由ABI 7300測(cè)定儀軟件自動(dòng)設(shè)定，每種組織樣品重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用ABI 7300儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件處理RT-PCR數(shù)據(jù)，并參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行效率校正。圖表采用SPSS 16.0軟件制作。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因和內(nèi)參基因的引物Table 1 Primers for real-time fluorescent quantitative PCR to detect transcriptions of target and internal reference genes

2 結(jié)果與分析

2.1 辛硫磷誘導(dǎo)對(duì)家蠶CyclinA基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

圖1表明，與對(duì)照組比，辛硫磷誘導(dǎo)組家蠶各個(gè)組織中CyclinA基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，尤以絲腺、腦、精巢和卵巢上升明顯；對(duì)照組家蠶中腸、脂肪體、絲腺及馬氏管中幾乎檢測(cè)不到CyclinA基因的表達(dá)，但經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后，CyclinA基因表達(dá)顯著提高，這可能是由于CyclinA存在不同的剪接變體[15]，在辛硫磷的刺激下，某些CyclinA剪接變體由原來(lái)的沉默狀態(tài)被激活，導(dǎo)致表達(dá)提高。

2.2 辛硫磷誘導(dǎo)對(duì)家蠶CyclinB及CyclinB3基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

圖2和圖3顯示，無(wú)論是對(duì)照組還是處理組家蠶，其CyclinB和CyclinB3基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)均基本一致：在中腸、絲腺、馬氏管中未表達(dá)，而在其他幾種組織中，除脂肪體外，試驗(yàn)組家蠶CyclinB及CyclinB3基因表達(dá)量均顯著提高，尤以精巢及卵巢為甚，表明辛硫磷對(duì)家蠶生殖細(xì)胞CyclinB及CyclinB3基因表達(dá)的影響較大。

圖1 辛硫磷誘導(dǎo)對(duì)家蠶CyclinA基因在各組織中轉(zhuǎn)錄的影響1.中腸；2.脂肪體；3.絲腺；4.腦；5.馬氏管；6.精巢； 7.卵巢； 同一組織不同處理相比，標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～4同

圖2 辛硫磷誘導(dǎo)對(duì)家蠶CyclinB基因在各組織中轉(zhuǎn)錄的影響Fig.2 Transcription levels of CyclinB gene in various tissues of Bombyx mori larvae before and after induction with phoxim

圖3 辛硫磷誘導(dǎo)對(duì)家蠶CyclinB3基因在各組織中轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Transcription levels of CyclinB3 gene in various tissues of Bombyx mori larvae before and after induction with phoxim

2.3 辛硫磷誘導(dǎo)對(duì)家蠶CyclinE基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，辛硫磷誘導(dǎo)組家蠶絲腺、腦及卵巢中CyclinE基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，而中腸、脂肪體顯著下調(diào)，精巢和馬氏管中無(wú)明顯變化。

圖4 辛硫磷誘導(dǎo)對(duì)家蠶CyclinE基因在各組織中轉(zhuǎn)錄的影響

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是對(duì)照組還是處理組，5齡3 d家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因在各組織中的轉(zhuǎn)錄水平均存在差異。對(duì)照組家蠶除CyclinE在脂肪體中高表達(dá)外，CyclinA、CyclinB、CyclinB3都是在精巢中表達(dá)量最高，而在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較低，表明這3個(gè)基因在家蠶精母細(xì)胞形成精子的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。這與筆者前期的研究結(jié)果[16]相同。

CyclinA能分別與CDK2和CDC2作用，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入并通過(guò)細(xì)胞周期的S期和M期[17]。CyclinB及 CyclinB3是細(xì)胞周期M期的限速因素[4]。經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后，CyclinA、CyclinB、CyclinB3在家蠶各組織中的表達(dá)量均顯著提高，推測(cè)其原因是家蠶受到辛硫磷刺激后，機(jī)體發(fā)生了一系列代謝變化，并動(dòng)員機(jī)體的代償適應(yīng)功能來(lái)抵抗和適應(yīng)各種應(yīng)激反應(yīng)，而應(yīng)激反應(yīng)分為應(yīng)激適應(yīng)和應(yīng)激損傷2個(gè)不同的階段，因此推測(cè)辛硫磷誘導(dǎo)24 h后，家蠶各種組織細(xì)胞處于應(yīng)激適應(yīng)階段，通過(guò)上調(diào)CyclinA、CyclinB及CyclinB3基因表達(dá)，加速各種組織細(xì)胞的分裂進(jìn)程。這可能是家蠶抵抗組織損傷，提高自身防御能力的一種措施。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，一旦機(jī)體不能適應(yīng)，應(yīng)激損傷便隨之發(fā)生，已有研究表明，有機(jī)磷能導(dǎo)致大鼠卵巢與精巢呈現(xiàn)衰退性變化[18-19]。本試驗(yàn)中家蠶的應(yīng)激損傷發(fā)生在誘導(dǎo)后多長(zhǎng)時(shí)間還有待于進(jìn)一步研究。

CyclinE屬于G1期細(xì)胞周期蛋白，其通過(guò)與CDK2結(jié)合，促進(jìn)G1/S期進(jìn)程，使細(xì)胞進(jìn)入S期后就不再依賴(lài)于細(xì)胞外促生長(zhǎng)因子而順利完成整個(gè)細(xì)胞周期[20]。在本試驗(yàn)中，對(duì)照組家蠶CyclinE基因在脂肪體中轉(zhuǎn)錄水平最高，這是由于家蠶脂肪體在5齡幼蟲(chóng)期以增加細(xì)胞數(shù)的方式迅速生長(zhǎng)，而在添加辛硫磷后，CyclinE基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，推測(cè)這與脂肪體是家蠶解毒代謝的重要器官有關(guān)。

本試驗(yàn)采用熒光定量PCR方法，研究了5齡家蠶經(jīng)辛硫磷誘導(dǎo)后，細(xì)胞周期蛋白家族基因CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE的轉(zhuǎn)錄情況，明確了其在5齡家蠶不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)于研究有機(jī)磷對(duì)家蠶的損傷機(jī)制具有重要的參考價(jià)值。

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Effect of phoxim on transcriptional activities of cyclin family genes in silkworm (Bombyxmori)

LIU Li-hua1,SHEN Wei-de2,LI Bing2

(1DepartmentofBiology,TonghuaNormalUniversity,Tonghua,Jilin134000,China;2SchoolofBasicMedicineandBiologicalSciences,SoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215123,China)

【Objective】 This study investigated the effect of phoxim on transcriptional activities of cyclin genes (CyclinA,CyclinB,CyclinB3,andCyclinE) in various tissues of 5thBombyxmoriinstar larvae to provide reference for the damage mechanism of phoxim pesticides to silkworm.【Method】 The transcription levels of cyclin genes in seven organs including brain,fat body,midgut,silk gland,Malpighian tube,testis and ovary after feeding folium mori treated by phoxim (4 μg/mL) to 5thBombyxmoriwere analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR with clear water as control.【Result】 Compared with the control group,transcriptional levels ofCyclinA,CyclinB,andCyclinB3 in various tissues were up-regulated 24 h after phoxim induction.CyclinEtranscriptional levels were significantly down-regulated in midgut and fat body,while it did not change significantly in testis and Malpighian tubules.Transcriptional levels ofCyclinEin other organs were unregulated.【Conclusion】 Increase of transcriptional levels ofCyclinA,CyclinBandCyclinB3 may be due to the response ofBombyxmorito phosphorus stress.The significant reduction ofCyclinEin midgut and fat body may be because midgut and fat body are detoxification metabolism organs.

Bombyxmori.;phoxim;cyclin;gene transcription

時(shí)間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.005

2014-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31072086)；吉林省科技廳項(xiàng)目(20130101100JC)；吉林省教育廳項(xiàng)目(2013493)

劉麗華(1972-)，女，吉林通化人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物資源與功能基因組研究。E-mail：liulihua209@163.com

沈衛(wèi)德(1951-)，男，江蘇蘇州人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物資源與功能基因組研究。 E-mail：shenwd@suda.edu.cn

S884.9+6

A

1671-9387(2015)09-0031-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.010.html