高效液相色譜法同時(shí)測定葡萄酒中5種酸性紅色素

王艷麗+姜濤+宿書芳+于文江+薛霞

摘要：通過對(duì)提取溶劑、流動(dòng)相條件、最大吸收波長及色譜條件的優(yōu)化，建立了一種同時(shí)測定葡萄酒中堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、熒光桃紅5種酸性紅色素的高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)甲醇提取后，采用Symmetry C18柱進(jìn)行分離 ，以甲醇-20 mmol/L醋酸銨為流動(dòng)相梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，各組分在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.1～1.0 mg/kg；在1、10、50 mg/kg三個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為85%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為1.5%～5.8%。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；酸性紅色素；高效液相色譜

中圖分類號(hào)：O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）09-0117-04

葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵釀制而成的一類酒精飲品。通常分紅葡萄酒和白葡萄酒兩種。因蘊(yùn)含多種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等對(duì)人體有益成分，其營養(yǎng)價(jià)值得到了廣泛認(rèn)可。近年來，有關(guān)葡萄酒制假售假現(xiàn)象屢有報(bào)道，為了增強(qiáng)紅葡萄酒的色澤同時(shí)降低生產(chǎn)成本，有不法企業(yè)向葡萄酒中添加人工合成色素，從而達(dá)到以假亂真的目的。長期飲用此類假酒，會(huì)對(duì)人的肝臟、腎臟等產(chǎn)生危害。因此對(duì)葡萄酒中可能添加的外來色素進(jìn)行檢測具有重要意義。

堅(jiān)牢紅（又名酸性紅13）、偶氮玉紅（又名酸性紅）、孟加拉紅（又名酸性紅94）、奇通紅S（又名酸性紅52）和熒光桃紅（又名酸性紅92）均屬于偶氮染料。GB2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定偶氮玉紅不得在葡萄酒中添加[1]，其它四種色素在我國和歐盟等國家也均不允許在食品中使用。

目前食品中合成色素的檢測方法主要有高效液相色譜法[2～8]、液質(zhì)聯(lián)用法[9]、電動(dòng)毛細(xì)管色譜法[10]和極譜法[11]。但同時(shí)測定葡萄酒中堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、和熒光桃紅等5種酸性紅色素的方法尚不多見。為有效監(jiān)控酸性工業(yè)染料在食品中的濫用，本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)快速測定葡萄酒中5種酸性紅色素的檢測方法。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters 2695型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS3基本型旋渦混合儀，德國IKA；KQ5200超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

甲醇，色譜純；醋酸銨，分析純；堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、熒光桃紅，Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將5種色素配制成質(zhì)量濃度為50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水依次稀釋成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3高效液相色譜條件

色譜柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；采集波長：200～630 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

流動(dòng)相：A為甲醇，B為20 mmol/L醋酸銨溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.4樣品處理

稱取葡萄酒樣品5.00 g于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液供HPLC測定。

2結(jié)果與分析

2.1提取劑的選擇

分別用純水、乙醇-氨水[12]和甲醇對(duì)葡萄酒中的色素進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以純水為提取劑，奇通紅S和熒光桃紅在樣品中的加標(biāo)回收率僅為26%～57%，可能是由于葡萄酒顯酸性，而熒光桃紅在酸性環(huán)境下易產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致回收率偏低；用乙醇-氨水溶液做提取劑，雖然回收率明顯提高，但需去除氨水，步驟繁瑣；用甲醇做提取劑時(shí)，樣品中的色素提取完全，5種色素均能夠得到理想的加標(biāo)回收率（見表2）。

2.2檢測波長的選擇

各組分經(jīng)色譜分離后，由二極管陣列檢測器掃描檢測，取得各組分最大吸收光譜（見圖1），各組分的最大吸收波長分別為：堅(jiān)牢紅，514 nm；偶氮玉紅，519 nm；孟加拉紅，562 nm；奇通紅S，557 nm；熒光桃紅，547 nm。由于醋酸銨在550 nm附近基本沒有吸收干擾，所以本實(shí)驗(yàn)將檢測波長確定為550 nm。在優(yōu)化的色譜條件下，各組分得到了有效分離，且避免了實(shí)際樣品中雜質(zhì)組分的干擾（見圖2）。

2.3方法的線性范圍與檢出限

對(duì)配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測試，以峰面積Y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸。

各色素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表3，表明5種色素在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍噪音計(jì)算方法檢出限，結(jié)果為0.1～1.0 mg/kg。

2.4回收率與精密度

在不含該5種色素的葡萄酒中，分別添加各色素含量為1、10、50 mg/kg三個(gè)濃度水平的標(biāo)樣，每個(gè)水平平行測定6次，其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表4。5種目標(biāo)化合物的平均添加回收率為85%～106%，RSD均小于6.0%。

3結(jié)論

本研究在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了高效液相色譜法檢測葡萄酒中5種酸性紅色素的樣品提取劑及檢測波長。采用甲醇作為提取劑，提取后直接上機(jī)，在550 nm波長下進(jìn)行檢測，可以得到清晰的譜圖，5種色素在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均高于0.999，檢測限0.1～1.0 mg/kg，加標(biāo)回收率85%～106%，RSD均低于6.0%。本方法具有前處理簡單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于葡萄酒中5種酸性紅色素的同時(shí)檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 2760-2011食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[2]李小平，趙永剛，陳曉紅，等.固相萃取-反相高效液相色譜法同時(shí)測定葡萄酒中7種合成色素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（12）：2566-2569.

[3]寧尚勇，高潔，許志強(qiáng)，等. 反相液相色譜法同時(shí)檢測蝦仁中合成色素的研究[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（4）：72-75.

[4]霍艷敏，王駿，張卉，等. 高效液相色譜法同時(shí)測定冰淇淋中的10種合成色素[J].分析測試學(xué)報(bào)，2011，30（6）：670-673.

[5]李小燕，李梅，陳其鋒，等.固相萃取-高效液相色譜檢測葡萄酒中羅丹明B[J] .食品科學(xué)，2011，32（8）：238-243.

[6]陳文軍. 高效液相色譜法測定食品中的合成色素酸性紅26[J] .光譜實(shí)驗(yàn)室，2012，29（5）：2848-2851.

[7]肖海龍，屠海云，王紅青，等. 反相高效液相色譜法快速測定食品中18種水溶性合成著色劑[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（2）：264-266.

[8]李瑋，芮昶，屠海云，等. 高效液相色譜法測定化妝品中的7種色素[J].分析試驗(yàn)室，2011，30（12）：85-89.

[9]林珍珍，張水峰，曹慧，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定肉制品中非法添加的14種酸性染料[J].中國食品學(xué)報(bào)，2013，3（5）：167-172.

[10]龍巍然，王興益，史振雨，等. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜同時(shí)測定食品中13種人工合成色素[J] .分析測試學(xué)報(bào)，2012，31（9）：1100-1104.

[11]陳文，王正猛，吳曉蓉，等. 單掃描極譜法連續(xù)測定食品中非食用色素酸性金黃和酸性大紅[J] .食品科學(xué)，2005，26（6）：210-212.

[12]吳國華，邵兵，趙婕，等. 餅干中酸性紅測定方法研究[J] .中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2004，14（3）：347.endprint

摘要：通過對(duì)提取溶劑、流動(dòng)相條件、最大吸收波長及色譜條件的優(yōu)化，建立了一種同時(shí)測定葡萄酒中堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、熒光桃紅5種酸性紅色素的高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)甲醇提取后，采用Symmetry C18柱進(jìn)行分離 ，以甲醇-20 mmol/L醋酸銨為流動(dòng)相梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，各組分在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.1～1.0 mg/kg；在1、10、50 mg/kg三個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為85%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為1.5%～5.8%。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；酸性紅色素；高效液相色譜

中圖分類號(hào)：O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）09-0117-04

葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵釀制而成的一類酒精飲品。通常分紅葡萄酒和白葡萄酒兩種。因蘊(yùn)含多種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等對(duì)人體有益成分，其營養(yǎng)價(jià)值得到了廣泛認(rèn)可。近年來，有關(guān)葡萄酒制假售假現(xiàn)象屢有報(bào)道，為了增強(qiáng)紅葡萄酒的色澤同時(shí)降低生產(chǎn)成本，有不法企業(yè)向葡萄酒中添加人工合成色素，從而達(dá)到以假亂真的目的。長期飲用此類假酒，會(huì)對(duì)人的肝臟、腎臟等產(chǎn)生危害。因此對(duì)葡萄酒中可能添加的外來色素進(jìn)行檢測具有重要意義。

堅(jiān)牢紅（又名酸性紅13）、偶氮玉紅（又名酸性紅）、孟加拉紅（又名酸性紅94）、奇通紅S（又名酸性紅52）和熒光桃紅（又名酸性紅92）均屬于偶氮染料。GB2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定偶氮玉紅不得在葡萄酒中添加[1]，其它四種色素在我國和歐盟等國家也均不允許在食品中使用。

目前食品中合成色素的檢測方法主要有高效液相色譜法[2～8]、液質(zhì)聯(lián)用法[9]、電動(dòng)毛細(xì)管色譜法[10]和極譜法[11]。但同時(shí)測定葡萄酒中堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、和熒光桃紅等5種酸性紅色素的方法尚不多見。為有效監(jiān)控酸性工業(yè)染料在食品中的濫用，本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)快速測定葡萄酒中5種酸性紅色素的檢測方法。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters 2695型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS3基本型旋渦混合儀，德國IKA；KQ5200超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

甲醇，色譜純；醋酸銨，分析純；堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、熒光桃紅，Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將5種色素配制成質(zhì)量濃度為50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水依次稀釋成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3高效液相色譜條件

色譜柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；采集波長：200～630 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

流動(dòng)相：A為甲醇，B為20 mmol/L醋酸銨溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.4樣品處理

稱取葡萄酒樣品5.00 g于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液供HPLC測定。

2結(jié)果與分析

2.1提取劑的選擇

分別用純水、乙醇-氨水[12]和甲醇對(duì)葡萄酒中的色素進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以純水為提取劑，奇通紅S和熒光桃紅在樣品中的加標(biāo)回收率僅為26%～57%，可能是由于葡萄酒顯酸性，而熒光桃紅在酸性環(huán)境下易產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致回收率偏低；用乙醇-氨水溶液做提取劑，雖然回收率明顯提高，但需去除氨水，步驟繁瑣；用甲醇做提取劑時(shí)，樣品中的色素提取完全，5種色素均能夠得到理想的加標(biāo)回收率（見表2）。

2.2檢測波長的選擇

各組分經(jīng)色譜分離后，由二極管陣列檢測器掃描檢測，取得各組分最大吸收光譜（見圖1），各組分的最大吸收波長分別為：堅(jiān)牢紅，514 nm；偶氮玉紅，519 nm；孟加拉紅，562 nm；奇通紅S，557 nm；熒光桃紅，547 nm。由于醋酸銨在550 nm附近基本沒有吸收干擾，所以本實(shí)驗(yàn)將檢測波長確定為550 nm。在優(yōu)化的色譜條件下，各組分得到了有效分離，且避免了實(shí)際樣品中雜質(zhì)組分的干擾（見圖2）。

2.3方法的線性范圍與檢出限

對(duì)配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測試，以峰面積Y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸。

各色素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表3，表明5種色素在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍噪音計(jì)算方法檢出限，結(jié)果為0.1～1.0 mg/kg。

2.4回收率與精密度

在不含該5種色素的葡萄酒中，分別添加各色素含量為1、10、50 mg/kg三個(gè)濃度水平的標(biāo)樣，每個(gè)水平平行測定6次，其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表4。5種目標(biāo)化合物的平均添加回收率為85%～106%，RSD均小于6.0%。

3結(jié)論

本研究在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了高效液相色譜法檢測葡萄酒中5種酸性紅色素的樣品提取劑及檢測波長。采用甲醇作為提取劑，提取后直接上機(jī)，在550 nm波長下進(jìn)行檢測，可以得到清晰的譜圖，5種色素在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均高于0.999，檢測限0.1～1.0 mg/kg，加標(biāo)回收率85%～106%，RSD均低于6.0%。本方法具有前處理簡單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于葡萄酒中5種酸性紅色素的同時(shí)檢測。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 2760-2011食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[2]李小平，趙永剛，陳曉紅，等.固相萃取-反相高效液相色譜法同時(shí)測定葡萄酒中7種合成色素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（12）：2566-2569.

[3]寧尚勇，高潔，許志強(qiáng)，等. 反相液相色譜法同時(shí)檢測蝦仁中合成色素的研究[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（4）：72-75.

[4]霍艷敏，王駿，張卉，等. 高效液相色譜法同時(shí)測定冰淇淋中的10種合成色素[J].分析測試學(xué)報(bào)，2011，30（6）：670-673.

[5]李小燕，李梅，陳其鋒，等.固相萃取-高效液相色譜檢測葡萄酒中羅丹明B[J] .食品科學(xué)，2011，32（8）：238-243.

[6]陳文軍. 高效液相色譜法測定食品中的合成色素酸性紅26[J] .光譜實(shí)驗(yàn)室，2012，29（5）：2848-2851.

[7]肖海龍，屠海云，王紅青，等. 反相高效液相色譜法快速測定食品中18種水溶性合成著色劑[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（2）：264-266.

[8]李瑋，芮昶，屠海云，等. 高效液相色譜法測定化妝品中的7種色素[J].分析試驗(yàn)室，2011，30（12）：85-89.

[9]林珍珍，張水峰，曹慧，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定肉制品中非法添加的14種酸性染料[J].中國食品學(xué)報(bào)，2013，3（5）：167-172.

[10]龍巍然，王興益，史振雨，等. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜同時(shí)測定食品中13種人工合成色素[J] .分析測試學(xué)報(bào)，2012，31（9）：1100-1104.

[11]陳文，王正猛，吳曉蓉，等. 單掃描極譜法連續(xù)測定食品中非食用色素酸性金黃和酸性大紅[J] .食品科學(xué)，2005，26（6）：210-212.

[12]吳國華，邵兵，趙婕，等. 餅干中酸性紅測定方法研究[J] .中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2004，14（3）：347.endprint

摘要：通過對(duì)提取溶劑、流動(dòng)相條件、最大吸收波長及色譜條件的優(yōu)化，建立了一種同時(shí)測定葡萄酒中堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、熒光桃紅5種酸性紅色素的高效液相色譜分析方法。樣品經(jīng)甲醇提取后，采用Symmetry C18柱進(jìn)行分離 ，以甲醇-20 mmol/L醋酸銨為流動(dòng)相梯度洗脫，二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，各組分在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.1～1.0 mg/kg；在1、10、50 mg/kg三個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為85%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為1.5%～5.8%。

關(guān)鍵詞：葡萄酒；酸性紅色素；高效液相色譜

中圖分類號(hào)：O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）09-0117-04

葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經(jīng)發(fā)酵釀制而成的一類酒精飲品。通常分紅葡萄酒和白葡萄酒兩種。因蘊(yùn)含多種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等對(duì)人體有益成分，其營養(yǎng)價(jià)值得到了廣泛認(rèn)可。近年來，有關(guān)葡萄酒制假售假現(xiàn)象屢有報(bào)道，為了增強(qiáng)紅葡萄酒的色澤同時(shí)降低生產(chǎn)成本，有不法企業(yè)向葡萄酒中添加人工合成色素，從而達(dá)到以假亂真的目的。長期飲用此類假酒，會(huì)對(duì)人的肝臟、腎臟等產(chǎn)生危害。因此對(duì)葡萄酒中可能添加的外來色素進(jìn)行檢測具有重要意義。

堅(jiān)牢紅（又名酸性紅13）、偶氮玉紅（又名酸性紅）、孟加拉紅（又名酸性紅94）、奇通紅S（又名酸性紅52）和熒光桃紅（又名酸性紅92）均屬于偶氮染料。GB2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定偶氮玉紅不得在葡萄酒中添加[1]，其它四種色素在我國和歐盟等國家也均不允許在食品中使用。

目前食品中合成色素的檢測方法主要有高效液相色譜法[2～8]、液質(zhì)聯(lián)用法[9]、電動(dòng)毛細(xì)管色譜法[10]和極譜法[11]。但同時(shí)測定葡萄酒中堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、和熒光桃紅等5種酸性紅色素的方法尚不多見。為有效監(jiān)控酸性工業(yè)染料在食品中的濫用，本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法同時(shí)快速測定葡萄酒中5種酸性紅色素的檢測方法。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters 2695型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS3基本型旋渦混合儀，德國IKA；KQ5200超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

甲醇，色譜純；醋酸銨，分析純；堅(jiān)牢紅、偶氮玉紅、孟加拉紅、奇通紅S、熒光桃紅，Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將5種色素配制成質(zhì)量濃度為50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水依次稀釋成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3高效液相色譜條件

色譜柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；采集波長：200～630 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

流動(dòng)相：A為甲醇，B為20 mmol/L醋酸銨溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.4樣品處理

稱取葡萄酒樣品5.00 g于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液供HPLC測定。

2結(jié)果與分析

2.1提取劑的選擇

分別用純水、乙醇-氨水[12]和甲醇對(duì)葡萄酒中的色素進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以純水為提取劑，奇通紅S和熒光桃紅在樣品中的加標(biāo)回收率僅為26%～57%，可能是由于葡萄酒顯酸性，而熒光桃紅在酸性環(huán)境下易產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致回收率偏低；用乙醇-氨水溶液做提取劑，雖然回收率明顯提高，但需去除氨水，步驟繁瑣；用甲醇做提取劑時(shí)，樣品中的色素提取完全，5種色素均能夠得到理想的加標(biāo)回收率（見表2）。

2.2檢測波長的選擇

各組分經(jīng)色譜分離后，由二極管陣列檢測器掃描檢測，取得各組分最大吸收光譜（見圖1），各組分的最大吸收波長分別為：堅(jiān)牢紅，514 nm；偶氮玉紅，519 nm；孟加拉紅，562 nm；奇通紅S，557 nm；熒光桃紅，547 nm。由于醋酸銨在550 nm附近基本沒有吸收干擾，所以本實(shí)驗(yàn)將檢測波長確定為550 nm。在優(yōu)化的色譜條件下，各組分得到了有效分離，且避免了實(shí)際樣品中雜質(zhì)組分的干擾（見圖2）。

2.3方法的線性范圍與檢出限

對(duì)配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測試，以峰面積Y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸。

各色素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見表3，表明5種色素在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍噪音計(jì)算方法檢出限，結(jié)果為0.1～1.0 mg/kg。

2.4回收率與精密度

在不含該5種色素的葡萄酒中，分別添加各色素含量為1、10、50 mg/kg三個(gè)濃度水平的標(biāo)樣，每個(gè)水平平行測定6次，其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表4。5種目標(biāo)化合物的平均添加回收率為85%～106%，RSD均小于6.0%。

3結(jié)論

本研究在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了高效液相色譜法檢測葡萄酒中5種酸性紅色素的樣品提取劑及檢測波長。采用甲醇作為提取劑，提取后直接上機(jī)，在550 nm波長下進(jìn)行檢測，可以得到清晰的譜圖，5種色素在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均高于0.999，檢測限0.1～1.0 mg/kg，加標(biāo)回收率85%～106%，RSD均低于6.0%。本方法具有前處理簡單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于葡萄酒中5種酸性紅色素的同時(shí)檢測。

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