高效免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響

常欣峰　林樂迎　宋春花

摘 要：目的：觀察高效免疫調(diào)節(jié)劑（HIS）對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響。方法：制備HIS含藥血清，采用MTT法檢測(cè)HIS含藥血清對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響，AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：與對(duì)照組比較，HIS含藥血清對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用（p<0.01），并呈明顯的時(shí)效量效關(guān)系；而隨著HIS劑量的增加，各含藥血清組細(xì)胞凋亡比例亦相應(yīng)增加，與對(duì)照組比較有顯著性差異（p<0.01）。結(jié)論：HIS對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，同時(shí)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：高效免疫調(diào)節(jié)劑；人宮頸癌HeLa細(xì)胞；增殖

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅廣大婦女的生命和健康。宮頸癌的治療是一個(gè)及其復(fù)雜的過程，如何糾正宮頸癌患者的整體免疫系統(tǒng)恢復(fù)到正常和協(xié)調(diào)上來，恢復(fù)機(jī)體的免疫監(jiān)視，防止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是宮頸癌治療的關(guān)鍵之一。為此，我們采用多價(jià)疫苗組成的高效免疫調(diào)節(jié)劑（high-efficiency immune modulators， HIS），制備成含藥血清，對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察HIS對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

雄性SD大鼠，體重250-280g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物中心許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003，動(dòng)物合格證號(hào)：43004700003244，級(jí)別：SPF級(jí)）。人宮頸癌HeLa細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株Bel-7402，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥研究所購(gòu)進(jìn)，贛南醫(yī)學(xué)院科研中心傳代培養(yǎng)。

1.2 藥品和試劑

胎牛血清（Gibco，10099-141）、1640培養(yǎng)基（Gibco，12800-058）、0.25%胰酶（Gibco，25200-056）、MTT Formazan（Sigma，M2003-1G）、PI Annexin Ⅴ apoptosis detection kit（美國(guó)BD公司，3018688）

2. 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物配置

HIS（中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺?00810107096.6）由江中腫瘤治療研究組提供，將其配置成0.3 g/mL，此為中劑量，再分別濃縮、稀釋成0.9 g/mL、0.1 g/mL，此為高、低劑量。4℃冰箱保存，大鼠按0.1 mL/100 g腹股溝皮下注射給藥，每日一次。

2.2 含藥血清制備

將20只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分成4組：A、正常對(duì)照組；B、HIS低劑量組；C、HIS中劑量組；D、HIS高劑量組。A組每天腹股溝皮下注射生理鹽水0.1mL/100g；B、C、D組分別給予低、中、高劑量HIS腹股溝皮下注射0.1mL/100g；連續(xù)治療3天，于末次給藥1h后，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清。將同組大鼠血清混勻， 56℃，30min水浴滅活，0.22μm薄膜濾菌器過濾，密封冷藏備用。

2.3 宮頸癌細(xì)胞HeLa的復(fù)蘇與培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞株復(fù)蘇，CO2孵箱（5%CO2，37℃，95%濕度）傳代培養(yǎng)，3代后用于以下實(shí)驗(yàn)。

2.4 MTT法檢測(cè)HIS含藥血清對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為5×10/mL接種至96孔培養(yǎng)板，每孔200uL，分4組（正常血清對(duì)照組，HIS含藥血清低、中、高劑量組），每組8個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液， 加含10%各組相應(yīng)血清的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入MTT 20μL，37℃作用4h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜 100μL，37℃、l0min輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

2.5 AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

常規(guī)培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)液， 加含10%相應(yīng)血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄培養(yǎng)液，胰酶消化，收集細(xì)胞，離心，棄上清。取適量AnnexinⅤ Binding Buffer 重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞劑量為1×106個(gè)/mL，取40uL 細(xì)胞（即4×104個(gè)）放入離心管中。每管加AnnexinⅤ、PI各2uL，混合后避光放置15min，上機(jī)檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HIS含藥血清對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，各組HIS含藥血清對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用（p<0.01），并呈明顯的時(shí)效量效關(guān)系。提示HIS含藥血清能夠抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖。（見表1）

3.2 AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著HIS劑量的增加，細(xì)胞凋亡比例亦相應(yīng)增加，分別為：（11.26±1.59）%、（17.67±1.72）%、（24.58±1.86）%，與正常血清對(duì)照組（6.92±1.07）%比較有顯著性差異（p<0.01）提示HIS含藥血清可以促進(jìn)Bel-7402細(xì)胞凋亡。

4 討論

宮頸癌是指發(fā)生在宮頸陰道部或移行帶的鱗狀上皮細(xì)胞及頸管內(nèi)膜的柱狀上皮細(xì)胞交界處的惡性腫瘤，其治療是一個(gè)復(fù)雜的過程，目前臨床常見的治療手段是手術(shù)和放、化療，其療效值得肯定，但仍存在著一些弊端和毒副作用。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了HIS對(duì)S180肉瘤小鼠腫瘤的影響，結(jié)果證實(shí)HIS可有效增強(qiáng)小鼠免疫功能[1]，同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 [2]。本次實(shí)驗(yàn)我們制備HIS含藥血清，對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察HIS對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明HIS能夠有效抑制HeLa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為進(jìn)一步在臨床應(yīng)用HIS治療宮頸癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]常欣峰，宋春花，羅寶英，等. 高效免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)S180肉瘤小鼠IL-6及IL-10表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29（12）：958-960.

[2]常欣峰， 宋春花， 張志花，等. 高效免疫調(diào)節(jié)劑促進(jìn)肉瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究[J].吉林中醫(yī)藥，2013，33（7）：717-719.