王 梓 ，張 浩，郝 迪，李 旭，袁 玲，王 蕾#(.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所心腦血管藥物研發(fā)中心，天津 30000;.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠生產(chǎn)供應(yīng)部，天津 300457)

參附強(qiáng)心丸是天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有公司達(dá)仁堂制藥廠研制，該藥根據(jù)“己椒藶黃丸”和“參附湯”化裁而來，具有益氣助陽，強(qiáng)心利水的功效，臨床治療慢性心力衰竭引起的心悸、氣短、胸悶喘促、面肢浮腫等療效較好。本研究旨在運(yùn)用藥理學(xué)試驗(yàn)的方法，觀察參附強(qiáng)心丸對(duì)慢性腎衰大鼠的溫陽利水作用，揭示參附強(qiáng)心丸的益氣、助陽、利水的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

Wistar 大鼠，雄性，體質(zhì)量260 ～280 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào):SCXK(京)2006-0009。

1.2 藥物

受試藥物:參附強(qiáng)心丸，由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有公司達(dá)仁堂制藥廠提供，棕色粉末，規(guī)格為1 g 生藥/g 藥粉，批準(zhǔn)文號(hào):zj001。陽性對(duì)照藥:地塞米松片，天津力生制藥股份有限公司，規(guī)格:0.75 mg/片，批準(zhǔn)文號(hào):1012029。造模藥物:腺嘌呤C5H5N5，購自上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，純度≥98.0%，批號(hào):101101。使用前用1.0%羧甲基纖維素鈉配制成2%腺嘌呤混懸液。

1.3 儀器

雙探頭放射免疫γ 計(jì)數(shù)器(SN-697);PL203 精密電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司制造);電子溫度計(jì);日本AU-640 型奧林巴斯全自動(dòng)生化分析儀;日本OLYMPUS B071型顯微攝影器材;IDA-2000 高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 造模方法

采用“單腎切除合并腺嘌呤灌胃法”制備大鼠慢性腎衰竭模型:選用雄性Wistar 大鼠，右腎切除術(shù)后1 周，以200 mg/(kg·d)腺嘌呤混懸液灌胃［1-3］，連續(xù)14 d。假手術(shù)對(duì)照組僅對(duì)大鼠皮膚和肌肉進(jìn)行切開、縫合操作，不切除腎臟。術(shù)后1 周對(duì)大鼠灌胃1.0%羧甲基纖維素鈉鹽(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)，連續(xù)應(yīng)用14 d。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法

術(shù)后1 周，將存活的大鼠根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、地塞米松對(duì)照組(0.2 mg/kg，相當(dāng)于臨床人用計(jì)量的10 倍)、參附強(qiáng)心丸2.14、1.07、0.54 g 生藥/kg 劑量組(分別相當(dāng)于臨床人用劑量的20、10、5 倍)，灌胃體積10 ml/kg，1 日1 次，共3 周。假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠灌胃同體積純凈水。

2.3 觀察方法及指標(biāo)

觀察大鼠體質(zhì)量、皮毛、活動(dòng)等一般生存情況。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清尿素氮(UREA)和肌酐(CREA)含量。對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，放免法測(cè)定血中血管緊張素Ⅱ(AngII)和醛固酮(ALD)含量。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，測(cè)定血清中鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)、鈣(Ca2+)、磷(P3+)含量。使用電子溫度計(jì)測(cè)定大鼠肛溫。取血結(jié)束后，將腎衰大鼠的左腎取出，稱取濕質(zhì)量，計(jì)算腎體比，腎體比(g/100 g BW)=腎臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。將大鼠稱質(zhì)量后的左腎，用刀片在矢狀面剖開以利于固定，置入12%甲醛中，制作石蠟切片，常規(guī)HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。將腎組織損傷病變程度分級(jí)為5 級(jí)，用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件多組間單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般生存狀態(tài)比較

肉眼觀察模型對(duì)照組大鼠出現(xiàn)皮毛稀疏，蜷臥少動(dòng)，消瘦等衰弱體征;參附強(qiáng)心丸3 個(gè)劑量組大鼠一般狀況較模型對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)，皮毛致密光亮。

3.2 各組大鼠腎功能及神經(jīng)內(nèi)分泌激素指標(biāo)比較

模型對(duì)照組大鼠的UREA、CREA 含量明顯升高;參附強(qiáng)心丸3 個(gè)劑量組和地塞米松對(duì)照組大鼠的UREA、CREA 水平均明顯低于模型對(duì)照組;模型對(duì)照組和參附強(qiáng)心受試組大鼠的AngⅡ顯著低于假手術(shù)對(duì)照組，ALD 明顯高于假手術(shù)對(duì)照組;參附強(qiáng)心丸2.14 g/kg 組和地塞米松對(duì)照組大鼠的ALD 較模型對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

3.3 各組大鼠不同電解質(zhì)指標(biāo)比較

模型對(duì)照組大鼠呈高鉀、低鈣、高磷血癥;參附強(qiáng)心丸2.14 g/kg 組大鼠可糾正低血鈣癥;參附強(qiáng)心丸3 個(gè)劑量組大鼠均能糾正高磷血癥;地塞米松對(duì)照組大鼠可糾正CRF 大鼠高鉀、低鈣、高磷血癥，使血鉀、血鈣、血磷接近正常水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

3.4 各組大鼠體溫、腎臟質(zhì)量及腎體比情況比較

模型對(duì)照組大鼠體溫明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，由于腎衰竭使體溫調(diào)節(jié)功能異常導(dǎo)致體溫過低，基礎(chǔ)代謝率下降;參附強(qiáng)心丸各劑量組未見體溫回升的作用;地塞米松組體溫過低，可能與糖皮質(zhì)激素對(duì)體溫調(diào)節(jié)中樞的抑制作用有關(guān)［4］。

表1 各組大鼠腎功能及神經(jīng)內(nèi)分泌激素指標(biāo)比較±s)Tab 1 Comparison of kidney function and neuroendocrine hormone indexes of rats in different groups(ˉx±s)

表1 各組大鼠腎功能及神經(jīng)內(nèi)分泌激素指標(biāo)比較±s)Tab 1 Comparison of kidney function and neuroendocrine hormone indexes of rats in different groups(ˉx±s)

注:與假手術(shù)對(duì)照組比較，△P ＜0.05，* P ＜0.001;與模型對(duì)照組比較，★P ＜0.05，#P ＜0.01，※P ＜0.001Note:vs.Sham operation control group，△P ＜0.05，* P ＜0.001;vs.model control★P ＜0.05，#P ＜0.01，※P ＜0.001

組別腎功能 神經(jīng)內(nèi)分泌激素UREA/(mmol/L) CREA/(umol/L) AngⅡ/(pg/ml) ALD/(ng/ml)假手術(shù)對(duì)照組(n=10) 5.90±0.55 23.94±2.32 1 862.123±95.253 0.265±0.058模型對(duì)照組(n=10) 40.48±8.15* 199.92±52.31* 760.802±412.678* 0.551±0.188△參附強(qiáng)心丸2.14 g 生藥/kg(n=10) 27.99±7.77# 122.55±37.26# 610.990±399.512 0.342±0.122★參附強(qiáng)心丸1.07 g 生藥/kg(n=10) 27.87±6.14# 130.05±27.53# 405.727±271.834 0.357±0.125參附強(qiáng)心丸0.54 g 生藥/kg(n=10) 27.36±6.90# 138.90±51.62# 492.861±461.638 0.532±0.195地塞米松0.2 mg/kg(n=10) 24.24±5.42※ 79.14±16.74※ 938.768±642.430★ 0.227±0.082※

表2 各組大鼠不同電解質(zhì)指標(biāo)比較(ˉx±s)Tab 2 Comparison of various electrolyte indexes of rats in different groups(ˉx±s)

模型對(duì)照組大鼠腎臟質(zhì)量明顯大于假手術(shù)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);參附強(qiáng)心各劑量組大鼠腎臟質(zhì)量較模型對(duì)照組均降低，其中2.14 g·kg-1組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);地塞米松對(duì)照組大鼠腎臟質(zhì)量降低最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，但由于該組大鼠體質(zhì)量明顯降低，因此，其與模型對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);參附強(qiáng)心丸2.14 g·kg-1組大鼠不但腎臟質(zhì)量明顯降低，該組大鼠體質(zhì)量增長趨勢(shì)亦得以改善，因此，計(jì)算所得腎體比亦明顯低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表3。

表3 各組大鼠體溫、腎臟質(zhì)量及腎體比情況比較(ˉx±s)Tab 3 Comparison of body temperature，ratio of the kidney weight versus kidney volume of rats in different groups(ˉx±s)

3.5 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)情況比較

肉眼觀察可見，正常對(duì)照組大鼠腎臟大小、硬度、顏色均正常，表面光滑，腎包膜容易剝離，切面皮髓質(zhì)分界清楚，皮質(zhì)無增厚現(xiàn)象。模型對(duì)照組大鼠腎臟體積明顯增大，腎臟表面成灰白色顆粒狀，為典型“大白腎”表征，腎包膜與腎實(shí)質(zhì)粘連不易剝離，切面皮髓質(zhì)分界不清。參附強(qiáng)心各劑量組和地塞米松對(duì)照組大鼠腎臟體積明顯小于模型對(duì)照組，且蒼白程度較輕，見圖1。

圖1 肉眼所見模型組大鼠腎臟改變圖Fig 1 The naked eye can see model group rats kidney change figure

腎臟病理學(xué)檢查結(jié)果表明，假手術(shù)對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無異常，被膜光滑，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，腎小球體積未見縮小或肥大，數(shù)目未見減少，腎小管上皮細(xì)胞未見變性、壞死或脫落，管腔中未見管型及結(jié)石，腎間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生。模型對(duì)照組大鼠病變明顯，腎體積增大顯著，多數(shù)腎小管高度擴(kuò)張，上皮細(xì)胞萎縮，腎小球數(shù)目減少，部分纖維化，間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤，部分腎組織充血、水腫及纖維組織增生，正常腎組織僅見小島狀分布或不見，見圖2。參附強(qiáng)心丸2.14、1.07、0.54 g/kg 劑量組與模型組大鼠相比，病變不同程度地明顯減輕，腎體積增大有所控制，擴(kuò)張的腎小管減少，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、腎組織充血、水腫及纖維組織增生均呈不同程度減輕，正常腎組織所占比例增多，其中以2.14、1.07 g/kg 劑量組更為顯著，見圖3。地塞米松組與模型組大鼠比較，病變減輕最明顯，腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、腎組織充血、水腫及纖維組織增生均明顯減輕，每視野能見到更多的正常腎組織，見圖4。

圖2 模型對(duì)照組腎組織病理圖(×100)Fig 2 Pathology of kidney tissue in mode group(×100)

圖3 2.14 g 生藥/kg 組腎組織病理圖(×100)Fig 3 Pathology of kidney tissue in dosage group with 2.14 g/kg Shenfuqiangxin pills in crude drug(×100)

4 討論

4.1 模型建立

圖4 地塞米松對(duì)照組腎組織病理圖(×100)Fig 4 Pathology of kidney tissue in dexamethasone group(×100)

中醫(yī)對(duì)慢性心力衰竭的病因病機(jī)概括為心腎陽虛為本，血瘀水停為標(biāo)。在對(duì)參附強(qiáng)心丸進(jìn)行藥理試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，在建立慢性心力衰竭的動(dòng)物模型之外，亦建立相應(yīng)的、能體現(xiàn)心陽虛、腎陽虛、乃至陽虛水泛的中醫(yī)病因模型，觀察其溫陽益氣、利水化飲的作用［5］。本試驗(yàn)選用“單腎切除合并腺嘌呤灌胃法”制備CRF 模型，高濃度腺嘌呤通過黃嘌呤氧化作用變?yōu)闃O難溶于水的2.8-二羥基嘌呤，其沉積于腎小管進(jìn)而阻塞腎小管，抑制氮質(zhì)化合物的排泄，該方法造成大鼠與人類CRF 較類似的代謝異常，包括氮質(zhì)血癥、胍類化合物的蓄積、氨基酸代謝異常、電解質(zhì)代謝紊亂和內(nèi)分泌異常，腎近曲小管、部分遠(yuǎn)曲小管及腎小球受損，腎臟呈大白腎甚至腎固縮，最終引起腎功能衰竭［3-8］。大鼠經(jīng)單側(cè)腎切除術(shù)后，由于留存腎工作負(fù)荷增加，導(dǎo)致腎臟呈代償性生長［9］，可促進(jìn)腺嘌呤導(dǎo)致腎衰竭的病理發(fā)展，縮短模型制備周期。本試驗(yàn)觀察到大鼠應(yīng)用200 mg/kg腺嘌呤灌胃，1 日1 次，連續(xù)14 d 后，大鼠呈日益消瘦，蜷縮拱背，精神萎頓，體毛脫落，血UREA、CREA 明顯升高等腎功能異常;血中K+、P3+水平明顯升高，血Ca2+明顯降低等電解質(zhì)異常。同時(shí)腎臟質(zhì)量和腎臟指數(shù)均明顯增加，腎臟表面滿布灰白色顆粒，光鏡下觀察，腎組織內(nèi)大量二羥基腺嘌呤結(jié)晶沉積，光鏡下可見模型對(duì)照組病變明顯，腎小管高度擴(kuò)張，上皮細(xì)胞萎縮，腎小球數(shù)目減少，部分纖維化。

4.2 參附強(qiáng)心作用機(jī)制

本試驗(yàn)結(jié)果表明，參附強(qiáng)心丸對(duì)CRF 大鼠治療作用明顯，其作用機(jī)制為:(1)溫煦陽氣:參附強(qiáng)心丸干預(yù)治療組較模型對(duì)照組大鼠腎陽虛癥狀明顯改善，體態(tài)舒展、皮毛光亮順滑、自主活動(dòng)正常，該組大鼠體征為溫煦滋養(yǎng)狀態(tài)，可表明參附強(qiáng)心具有益氣溫陽之功。(2)生化指標(biāo)的改善:中醫(yī)腎陽虛在臨床檢驗(yàn)指標(biāo)的體現(xiàn)之一，即為CREA、UREA 的異常［10］。中藥對(duì)腎陽虛的治療作用，可量化地體現(xiàn)在對(duì)生化指標(biāo)的改善方面，3 個(gè)劑量組大鼠的參附強(qiáng)心丸均可使CRF 異常升高的CREA、UREA 明顯下降，表明該藥對(duì)腎臟濾過功能的修復(fù)作用。(3)糾正水鈉潴留:“水鈉潴留”用中醫(yī)病機(jī)可描述為“水飲內(nèi)?！薄瓣柼撍骸保R床最明顯的體征為水腫，但動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)水腫的觀察欠直觀。ALD 可反映機(jī)體水鈉潴留狀態(tài)［11］，是觀察藥物利水的客觀指標(biāo)之一。參附強(qiáng)心丸2.14 g/kg 可明顯降低腎陽虛大鼠ALD 含量，充分說明其利水的確切功效。(4)糾正電解質(zhì)紊亂:參附強(qiáng)心丸對(duì)高鉀、低鈣、高磷血癥有明顯糾正功效。鉀的平衡失調(diào)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，高血鉀癥可致嚴(yán)重的心律失常甚至心搏驟停，高血磷和低鈣血癥可引起繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，引起骨質(zhì)脫鈣、骨軟化、纖維性骨炎等腎性骨病，因此對(duì)高鉀、低鈣、高磷血癥的及時(shí)糾正具有重要意義。(5)對(duì)腎臟組織結(jié)構(gòu)的改善:參附強(qiáng)心丸可使病變的腎臟組織結(jié)構(gòu)得以修復(fù)，使擴(kuò)張腎小管減少，炎性、充血、水腫、增生等病理變化均減輕。

4.3 AngⅡ指標(biāo)的偏低

AngⅡ指標(biāo)數(shù)據(jù)表明，本試驗(yàn)中采取的“單側(cè)腎切除合并灌胃腺嘌呤”法制備的CRF 大鼠AngⅡ并未升高，反而明顯降低，其原因可能是由于只有一側(cè)殘留病腎，慢性腎衰造成大鼠機(jī)體鈉和水排出降低，鈉潴留又使血容量擴(kuò)張。而同時(shí)腎內(nèi)壓并不低于原有水平，因而腎素分泌不增加［12］。因此，在血容量增加的條件下，大鼠血漿內(nèi)腎素值則相比之下低于正常，相應(yīng)的由其轉(zhuǎn)換的AngⅡ的數(shù)值亦低于正常。這與臨床CRF 的AngⅡ不一致［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道，腺嘌呤150 mg/kg 應(yīng)用4 周后，大鼠血漿AngⅡ和腎素均降低，故“單腎切除合并腺嘌呤灌胃法”制備CRF 模型在RAAS 系統(tǒng)的相關(guān)機(jī)制研究中有一些不太合適［14］。因此，今后在進(jìn)行CRF 研究時(shí)，需對(duì)動(dòng)物模型做以下優(yōu)化:(1)選用化學(xué)藥物造模時(shí)，要充分考慮該類化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的生化指標(biāo)變化特點(diǎn)。(2)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物選用適當(dāng)?shù)暮喜⑹中g(shù)術(shù)式，如合并腎下腹主動(dòng)脈缺血再灌術(shù)等［16］，爭取在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)心腎功能的共損、互損，縮短研究周期，并相應(yīng)增加心腎損傷程度，高度模擬臨床心腎綜合征的病變特點(diǎn)。

［1］ 肖煒，馬云，傅江南.慢性腎衰動(dòng)物模型方法學(xué)研究現(xiàn)狀［J］. 中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志，2002，12(3):176-179.

［2］ Augustin AJ，Lutz J. Intestinal，hepatic and renal production of thiobarbituric acid reactive substances and myeloperoxidase activity after temporary aortic occlusion and reperfusion［J］.Life Sci，1991，49(13):961-968.

［3］ 趙宗江，魏晨，楊美娟，等. 溫脾湯對(duì)腺嘌呤性慢性腎衰竭大鼠腎功能的保護(hù)作用［J］. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，29(6):461-464.

［4］ 楊寶峰，蘇定馮. 藥理學(xué)［M］. 8 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2013，336.

［5］ 張建偉.從腎論治慢性心衰的體會(huì)［J］. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，2(4):243-244.

［6］ 陳原，李谷霞，張國英，等. 腎藥對(duì)腺嘌呤所致腎功衰動(dòng)物腎功能保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國中醫(yī)藥科技，2003，10(5):279-281.

［7］ 候連兵，鄧虹珠，陳志良，等. 三種慢腎衰動(dòng)物模型的制備及意義［J］.華西藥學(xué)雜志，1994，9(3):169-171.

［8］ 馬云，侯連兵，肖煒.腎衰寧分散片治療腺嘌呤致慢性腎衰竭大鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2007，30(4):432-435.

［9］ 吳階平. 泌尿外科學(xué):上卷［M］. 濟(jì)南:山東科學(xué)技術(shù)出版社，2004:1927.

［10］ 王學(xué)美，富宏，劉庚信，等. 健脾排毒丸治療腺嘌呤誘導(dǎo)大鼠慢性腎功能衰竭的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2005，11(6):36-38.

［11］ 田莉婷，楊海俠，李煜國，等. 溫補(bǔ)脾腎化氣利水法對(duì)肝硬化腹水醛固酮的影響［J］.陜西中醫(yī)，2014，35(2):171-173.

［12］ 陸再英，鐘南山. 內(nèi)科學(xué)［M］. 7 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2008，253.

［13］ 韋先進(jìn)，朱辟疆.慢性腎功能衰竭血漿心鈉素、腎素-血管緊張素系統(tǒng)的改變［J］.臨床薈萃，1999，14(6):264-265.

［14］ 李淑雯，吳清和，黃萍，等.縮泉丸對(duì)腎虛多尿大鼠腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的影響［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(11):108-110.

［15］ 王蕾，郝迪，李旭，等.心腎綜合征動(dòng)物模型研究進(jìn)展［J］. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(11):1496-1498.

［16］ Oyar E?，Kiri? I，Gülmen S，et al. Adrenomedullin attenuates aortic cross-clamping-induced myocardial injury in rats［J］. Am J Surg，2011，201(2):226-232.