李良玉，王欣卉，宋大巍，于 偉，賈鵬禹

1 黑龍江八一農(nóng)墾大學國家雜糧工程技術研究中心;2 黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319

松花粉(Pine pollen)是我國特有馬尾松和油松的花粉，藥名松花、松黃，為鮮黃色或淡黃色細粉，其味甘平無毒，松花粉含有多種蛋白質、氨基酸、核酸、多糖纖維素、不飽和脂肪酸，還含有多酚類化合物、核酸和植物甾醇等生物活性成分，具有很高的保健價值［1-3］，具有收斂止血、燥濕斂瘡之功效，主治外傷出血、濕疹、黃水瘡、皮膚糜爛、膿水淋漓等［4，5］。松花粉具有抗衰老、降血糖、降血脂、調節(jié)免疫等作用［6-11］。目前，對松花粉的研究較多但主要集中在松花粉多糖、蛋白、不飽和脂肪酸等方面，對于天然黃色素的研究還沒有報道。超聲-微波協(xié)同萃取技術是一種新型的高新提取技術，其將超聲波和微波有機的結合起來，充分利用超聲波的空化和微波的高能作用，將超聲波振動能和微波能直接作用于樣品，達到良好的提取效果［12］。目前，對超聲/微波協(xié)同提取的應用報道，主要集中在多糖的提取中，對多酚、黃酮、有機酸等其它成分的提取有一定報道，但在天然色素的提取方面研究較少［13］。本文以東北野生馬尾松松花粉為原料，研究超聲/微波協(xié)同提取松花粉黃色素的工藝，將超聲與微波有機的結合，發(fā)揮各自在提取中的優(yōu)勢，最大限度地提高提取得率，并對松花粉黃色素的穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)的研究，希望能為進一步開發(fā)利用馬尾松這一林產(chǎn)資源提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

東北野生馬尾松松花粉市購;甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、丙酮、苯、葡萄糖、蔗糖、苯甲酸鈉、檸檬酸、碳酸鈉、氯化鉀、氯化鈉、三氯化鋁、三氯化鐵、氯化鋅、氯化銅、氯化鈣、亞硫酸鈉、30%雙氧水、維生素C等皆為分析純。

1.2 儀器與設備

Pharo300 紫外可見光分光光度計，默克密理博;CW-2000 型超聲一微波協(xié)同提取儀，上海新拓微波溶樣測試技術有限公司;恒溫水浴箱，上海森信實驗儀器有限公司;MD100-2 型電子分析天平，沈陽華騰電子有限公司;酸度計S220K，梅特勒·托利多公司。

2 實驗方法

2.1 松花粉黃色素的提取方法

對松花粉黃色素的提取工藝采用單因素實驗得到了優(yōu)化的提取工藝參數(shù)和操作步驟，具體操作過程如下:提取劑為95%乙醇［14］，微波功率300 W，提取溫度50 ℃，提取時間10 min，料液比1∶15 mL/g，得到松花粉黃色素。

2.2 松花粉黃色素光譜特性的測定

取松花粉黃色素乙醇溶液，紫外-可見分光光度計在波長范圍為200～600 nm 內進行掃描，測得最大吸收波長后，在該波長下進行松花粉黃色素吸光值的測定，作為評價松花粉黃色素穩(wěn)定性的標準［15］。

2.3 超聲/微波協(xié)同提取松花粉黃色素的工藝優(yōu)化研究

2.3.1 微波功率對松花粉黃色素提取的影響

稱取松花粉10 g 共5 份，提取劑為95%乙醇，提取時間15 min，液料比20∶1 mL/g，以吸光度為指標研究不同微波功率100、200、300、400、500 W 對松花粉黃色素提取效果的影響，重復三次。

2.3.2 液料比對松花粉黃色素提取的影響

稱取松花粉10 g 共7 份，提取劑為95%乙醇，微波功率300 W、提取時間15 min，以吸光度為指標研究不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL/g)對松花粉黃色素提取效果的影響，將液料比統(tǒng)一調配至20∶1 mL/g 后測定吸光度，重復三次。

2.3.3 提取時間對松花粉黃色素提取的影響

稱取松花粉10 g 共5 份，提取劑為95%乙醇，微波功率300 W，液料比20∶1 mL/g，以吸光度為指標研究不同提取時間5、10、15、20、25 min 對松花粉黃色素提取效果的影響，重復三次。

2.3.4 響應面優(yōu)化實驗方法

在單因素實驗基礎上，根據(jù)二次回歸組合實驗設計原理，以松花粉吸光度為響應值，設計微波功率、提取時間、液料比三個因素進行響應面分析實驗，實驗設計見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels for response surface analysis

2.4 松花粉黃色的穩(wěn)定性研究

2.4.1 松花粉黃色素溶解性研究［16］

將松花粉黃色素溶液冷凍干燥，稱取0.01 g 的松花粉黃色素粉末7 份分別加入10 mL 的蒸餾水、甲醇、乙醚、無水乙醇、丙酮、氯仿、苯，攪拌均勻，加蓋，室溫下避光浸取3 h，觀察溶解情況，考察松花粉黃色素的溶解性。

2.4.2 溫度對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響［17］

取松花粉黃色素提取液50 mL 共5 份分別置于5 支具塞試管中，加塞后分別置于20、40、60、80、100℃的恒溫水浴鍋中加熱3 h，取出后冷卻至室溫，每30 min 測定吸光度一次，重復3 次。

2.4.3 pH 值對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響［18］

取松花粉黃色素提取液9 mL 共14 份分別置于14 支具塞試管中，用1 mol/L HCL 與1 mol/L NaOH調pH 值為1～14，用蒸餾水補足至10mL，再取混勻后加塞，黑暗處放置4h 后測其吸光度，重復3 次。

2.4.4 光照對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響［19］

取松花粉黃色素提取液50 mL 以及松花粉黃色素稀釋液50 mL(松花粉黃色素提取液40 mL+10 mL 無水乙醇)各1 份分別置于2 支具塞試管中，加塞置陽光下和紫外燈下照射3 h，每30 min 測吸光度一次，重復3 次。

2.4.5 金屬離子對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響［20］

取松花粉黃色素提取液9 mL 共30 份置于30支具塞試管中，再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 6 種相同濃度1 mg/mL 的不同金屬離子溶液(K+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Cu2+、Al3+)，用蒸餾水補足至10 mL，混勻后加塞，黑暗中放置4 h 后測定其吸光度，重復3 次。

2.4.6 食品添加劑對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響［21］

取松花粉黃色素提取液9 mL 共40 份置于40支具塞試管中，再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL5 種相同濃度0.1%的不同食品添加劑溶液(維生素C、檸檬酸、碳酸鈉、苯甲酸鈉、亞硫酸鈉)和3種相同濃度10%的不同食品添加劑溶液(氯化鈉、葡萄糖、蔗糖)，用蒸餾水補足至10 mL，混勻后加塞，黑暗中放置4 h，測定其吸光度，重復3 次。

2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3 次，并采用Origin 8.0 軟件制圖，采用SAS8.2 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

3 結果與分析

3.1 松花粉黃色素光譜特性的測定結果

松花粉黃色素光譜特性的測定結果，見圖1。由圖1 可知，松花粉黃色素溶液的紫外光譜掃描發(fā)現(xiàn)其光譜在362 nm 處有吸收峰，選擇可見光范圍內最大吸收波長362 nm 作為吸光度測定波長。

圖1 松花粉黃色素的紫外-可見光吸收光譜曲線Fig.1 UV-Vis spectrum of pine pollen yellow pigment

3.2 超聲/微波協(xié)同提取松花粉黃色素的提取工藝研究結果與分析

3.2.1 單因素實驗結果

3.2.1.1 微波功率對松花粉黃色素提取的影響

由圖2-a 可知隨著微波功率的增大，松花粉黃色素的吸光度呈現(xiàn)上升趨勢。在100～300 W 時范圍內，呈現(xiàn)上升的趨勢，在300 W 時，吸光度達到最大值。在300～500 W 范圍內，提取率逐步下降?？赡艿脑蚴钱斘⒉üβ试?00～300 W 時，微波功率不足乙醇溶劑也達到足夠穿透能力。因此，吸光度呈現(xiàn)上升趨勢，微波超過300 W 兩者達到最適平衡狀態(tài)，吸光度也達到最大值。當微波功率大于300 W 以后會引起色素結構的變化而使吸光度下降。因此，本實驗選擇響應面優(yōu)化微波功率范圍為在以300 W 為中心200 W 到400 W 之間。

圖2 微波功率(a)、液料比(b)及提取時間(c)對松花粉黃色素提取的影響Fig.2 Effects of microwave power(a)，liquid/solid ratio(b)and extraction time(c)on the extraction of pine pollen yellow pigment

3.2.1.2 液料比對松花粉黃色素提取的影響

由圖2-b 可以看出，隨著提取液料比的不斷增大，松花粉黃色素的吸光度值呈現(xiàn)上升的趨勢;當液料比達到30∶1 mL/g 后，吸光度趨于平衡。因此，本實驗選擇響應面優(yōu)化提取液料比范圍為在以25∶1 mL/g 為中心20∶1 mL/g 到30∶1 mL/g 之間。

3.2.1.3 提取時間對松花粉黃色素提取的影響

由圖2-c 可知隨著提取時間的延長，松花粉黃色素吸光度呈現(xiàn)上升趨勢。在5～15 min 時，提取率呈現(xiàn)快速上升的趨勢，在提取15 min 左右達到最大，超過20 min 有下降的趨勢，這可能是提取時間過長影響了色素的穩(wěn)定性。因此，本實驗選擇響應面優(yōu)化提取時間范圍為在以15 min 為中心10 min到20 min 之間。

3.2.2 響應面實驗結果與分析

基于單因素實驗結果確定的最佳條件，以微波功率(W)，液料比(mL/g)，提取時間(min)，這三個因素為自變量(分別以X1、X2、X3表示)，以松花粉黃色素吸光度為響應值設計3 因素共17 個實驗點的三元二次回歸正交旋轉組合實驗，保證實驗點最少前提下提高優(yōu)化效率，運用SAS 8.2 軟件處理，實驗結果見表2。

表2 實驗安排表以及結果Table 2 Scheme and results of regression orthogonal rotary design

3.2.2.1 多因素組合優(yōu)化實驗分析

采用SAS 8.2 統(tǒng)計軟件對優(yōu)化實驗進行響應面回歸分析(RSREG)，回歸方程以及回歸方程各項的方差分析結果見表3，二次回歸參數(shù)模型數(shù)據(jù)如表4所示。

表3 回歸方程各項的方差分析表Table 3 The ANOVA of regression equations

由表3 可以看出:二次回歸模型的F 值為5.57，P 值＜0.05，大于在0.05 水平上的F 值，而失擬項的F 值為4.61，小于在0.05 水平上的F 值，說明該模型擬和結果好。一次項、二次項和交互項的F值均大于0.05 水平上的F 值，說明其對提取率有顯著的影響。

表4 二次回歸模型參數(shù)表Table 4 The parameters of quadratic regression

以松花粉黃色素的吸光度為Y 值，得出微波功率(W)、液料比(mL/g)、提取時間(min)的編碼值為自變量的三元二次回歸方程為:

3.2.2.2 最優(yōu)提取條件確定

為了進一步確證最佳點的值，采用SAS 軟件的Rsreg 語句對實驗模型進行響應面典型分析，以獲得最大提取效果時的條件。經(jīng)典型性分析得最優(yōu)提取條件和提取率為:微波功率351.4 W，液料比25.4 mL/g，提取時間11.9 min 時，松花粉黃色素的吸光度值最大，理論最大值為3.491。

3.2.3 驗證實驗

按照最優(yōu)提取條件進行實驗，重復三次。結果麥松花粉黃色素的吸光度值3.49±0.3，實驗值與模型的理論值非常接近，且重復實驗相對偏差不超過2%，說明實驗條件重現(xiàn)性良好。結果表明，該模型可以較好的反映出超聲/微波協(xié)同提取松花粉黃色素的條件。

3.3 松花粉黃色素的穩(wěn)定性研究

3.3.1 松花粉黃色素溶解性能

松花粉黃色素在不同溶劑中的溶解性能實驗結果見表5。

表5 不同溶劑中松花粉黃色素的溶解性能Table 5 The solubility of pine pollen yellow pigment in different solvents

由表5 可以看出，隨著溶劑極性的不斷減弱松花粉黃色素的溶解性不斷提高，可以認為松花粉黃色素為一種脂溶性色素。

3.3.2 溫度對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響

溫度對松花粉黃色素穩(wěn)定性影響的實驗結果，見表6。

表6 溫度對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響Table 6 Effects of temperature on pine pollen pigment stability

由表6 可以看出，在20～60 ℃時松花粉黃色素穩(wěn)定;當溫度為80 ℃時，松花粉黃色素的吸光度呈先增加后下降的趨勢，在0.5 h 內吸光度增加，這是由于溫度升高有利于松花粉黃色素分子的熱運動促進色素的溶解，1 h 后吸光度呈下降的趨勢，3 h 后趨于平衡，保留率較高，溫度低于80 ℃松花粉黃色素穩(wěn)定性較好;當溫度超過80 ℃后，松花粉黃色素穩(wěn)定性急劇下降保留率低穩(wěn)定性差，因此該色素應避免在80 ℃以上的環(huán)境下使用。

3.3.3 pH 值對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響

pH 值對松花粉黃色素穩(wěn)定性影響的實驗結果，見表7。

表7 pH 值對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響Table 7 Effects of pH on pine pollen pigment stability

由表7 可以看出，隨著pH 值的提高，松花粉黃色素的吸光度成上升趨勢，酸性條件下穩(wěn)定性較好，堿性環(huán)境對其有增色作用。

3.3.4 光照對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響

光照對松花粉黃色素穩(wěn)定性影響的實驗結果，見表8。

表8 光照對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響Table 8 Effects of irradiation on pine pollen pigment stability

由表8 可以看出，無論是日光照射還是紫外燈照射對色素的吸光度變化幅度很小，顏色基本沒有變化，說明松花粉黃色素的光穩(wěn)定性良好。

3.3.5 金屬離子對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響

金屬離子對松花粉黃色素穩(wěn)定性影響的實驗結果，見表9。

表9 不同金屬離子對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響Table 9 Effects of different metal ions on pine pollen pigment stability

由表9 可以看出，K+、Mg2+、Ca2+、Al3+等四種離子對松花粉黃色素的穩(wěn)定性影響很小;Cu2+對松花粉黃色素的穩(wěn)定性有一定的影響，當Cu2+濃度較低時Cu2+自身顏色影響測定導致吸光度升高，濃度較高時Cu2+影響松花粉黃色素的穩(wěn)定性導致吸光度下降;Fe3+對松花粉黃色素的穩(wěn)定性影響較大，當Fe3+濃度較低時出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象導致吸光度升高，F(xiàn)e3+濃度較高時松花粉黃色素的穩(wěn)定性較差導致吸光度下降，但仍高于對照。

3.3.6 食品添加劑對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響

食品添加劑對松花粉黃色素穩(wěn)定性影響的實驗結果，表10。

表10 食品添加劑對松花粉黃色素穩(wěn)定性的影響Table 10 Effects of food additives on pine pollen pigment stability

由表10 可以看出，葡萄糖、氯化鈉、蔗糖和亞硫酸鈉對色素的吸光度變化幅度很小，顏色基本無變化，說明其對松花粉黃色素的穩(wěn)定性沒有顯著的影響;碳酸鈉和苯甲酸鈉對色素的吸光度變化幅度較大，顏色增深，說明其對松花粉黃色素的穩(wěn)定性有顯著的增色作用;而維生素C 和檸檬酸對色素的吸光度變化幅度較大，顏色減弱，說明其對松花粉黃色素的穩(wěn)定性有顯著的減色作用。

4 結論

通過實驗研究可以得到松花粉黃色素超聲/微波協(xié)同的最佳提取工藝參數(shù)為:微波功率351.4 W，液料比25.4 mL/g，提取時間11.9 min，松花粉黃色素的吸光度值最大為3.49;在溶解性方面松花粉黃色素微溶于水，速溶于有機溶劑，屬于脂溶性色素，最大吸收波長為362 nm;穩(wěn)定性方面，在低于80 ℃的條件下，色素的熱穩(wěn)定性較好，應在80 ℃以下生產(chǎn)和存放;該色素對光不敏感，光穩(wěn)定性良好;松花粉黃色素酸性條件下穩(wěn)定性較好，堿性環(huán)境對其有增色作用;金屬離子K+、Mg2+、Ca2+和Al3+對色素穩(wěn)定性影響小，Cu2+和Fe3+對色素穩(wěn)定性有一定的影響;食鹽、葡萄糖、蔗糖、苯甲酸鈉的影響較小，碳酸鈉和苯甲酸鈉對色素稍有增色作用，維生素C 和檸檬酸稍有減色作用。

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