周思多，王 曉，馮金紅，耿巖玲，趙恒強(qiáng)*

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，泰安 271018;2 山東省科學(xué)院中藥過(guò)程控制研究中心

山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省分析測(cè)試中心，濟(jì)南 250014

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)，又稱(chēng)早老性癡呆癥，是發(fā)生于老年和老年前期以進(jìn)行性神經(jīng)退化為特征的大腦退行性病變［1］。隨著世界老齡人口的不斷增加，AD 病發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外呈不斷上升的趨勢(shì)，成為威脅老年人生命健康的主要疾病之一。目前，多方面的研究表明，AD 的病理與患者神經(jīng)間隙中乙酰膽堿酯酶活性過(guò)高具有重要關(guān)系［2，3］。因此，乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesterase Inhibitor，AChEI)藥物是目前研究最多、最為活躍的抗老年性癡呆癥藥物。

我國(guó)中藥材資源極其豐富，中藥治療老年癡呆歷史悠久，有豐富的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。從中藥千層塔中發(fā)現(xiàn)的石杉?jí)A甲［4］和黃皮酰胺［5］，經(jīng)藥理研究表明對(duì)AD 患者有顯著的治療作用。從中草藥中尋找抗老年癡呆成分，為研制新型抗老年癡呆創(chuàng)新藥物及開(kāi)發(fā)中草藥資源均具有重要意義。目前，已公開(kāi)的AChE 抑制劑的主流篩選方法均由Ellman法改進(jìn)而來(lái)。這些方法以大鼠腦組織勻漿為酶源，且沒(méi)有微量化［6-8］。孫黔云等［9］發(fā)展了乙酰膽堿酯酶抑制劑微量篩選模型，該方法具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以大大加快中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)進(jìn)程。

本研究采用微量化AChE 抑制劑篩選模型，對(duì)48 種中草藥的乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行大規(guī)模的系統(tǒng)篩選，為尋找來(lái)自中草藥的乙酰膽堿酯酶抑制劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

電鰻AChE 購(gòu)自Sigma 公司;碘化硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine iodide，AChI)購(gòu)自Fluka 公司;5，5-二硫雙硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB)購(gòu)自Sigma 公司;毒扁豆堿(Eserine)購(gòu)自Sigma 公司;其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水(18.2 MΩ)。本實(shí)驗(yàn)所用的中草藥樣品購(gòu)于濟(jì)南市建聯(lián)大藥店，由山東省分析測(cè)試中心王曉研究員鑒定。

1.2 儀器與設(shè)備

Tecan Infinite M200 型多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN 集團(tuán)公司);MICROTESTTM96 孔酶標(biāo)板(美國(guó)BD 公司);KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);R201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);FA1104 型電子天平(上海精天電子儀器廠(chǎng));Milli-Q(18.2 MΩ)超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司)。

1.3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品1.0 g，置于100 mL 具塞三角燒瓶中，加入50 mL(水、80%乙醇、乙酸乙酯、石油醚)提取溶劑，于超聲提取器中提取30 min，重復(fù)提取一次過(guò)濾，濾液合并，轉(zhuǎn)入100 mL 旋蒸瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，稱(chēng)重。使用時(shí)依次用50%乙醇溶解并分別稀釋至50 mg/L 和1000 mg/L，備用。

1.4 溶液的配制

乙酰膽堿酯酶(AChE):準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量電鰻AChE(2.32 mg，500 U)，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸鹽緩沖液稀釋至1.0 U/mL。

磷酸鹽緩沖液(PBS)(50 mmol/L，pH=7.4):用100 mM Na2HPO4和NaH2PO4，按照體積比VNa2HPO4:VNaH2PO4=77.4:22.6 配制。

顯色劑(2.5 mmol/L，DTNB 溶液):準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量DTNB，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸鹽緩沖液稀釋到一定濃度。

底物(10 mmol/L，AChI 溶液):準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量AChI，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸鹽緩沖液稀釋至一定濃度。

終止劑(1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)):準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量SDS，用磷酸鹽緩沖液稀釋至一定濃度。

陽(yáng)性對(duì)照品:毒扁豆堿(Eserine)(7.69×10-2mg/L、3.85 mg/L)，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸鹽緩沖液配制。

1.5 篩選模型

1.5.1 實(shí)驗(yàn)原理

碘化硫代乙酰膽堿(AChI)在乙酰膽堿酯酶(AChE)作用下分解，生成硫代膽堿(Thiocholine)，硫代膽堿與顯色劑DTNB 迅速作用，生成在405 nm處有光吸收的黃色物質(zhì)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用改良的Ellman 方法進(jìn)行［10］。首先，取溶于50%乙醇的樣品溶液20 μL，依次加入80 μL PBS、40 μL 2.5 mmol/L 的DTNB、20 μL 酶液(1.0 U/mL)，振蕩混勻，37 ℃預(yù)孵10 min，然后加入40 μL 10 mmol/L 的底物，37 ℃反應(yīng)10 min，加入60 μL 1%的SDS 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm吸收值，記為A樣品。

1.6 中草藥活性成分的篩選

方法如1.5.2 所述:取20 μL 溶于50%乙醇的樣品溶液，依次加入各種反應(yīng)試劑，測(cè)其A405，記為A樣品;同時(shí)每批樣品都做溶劑對(duì)照，即用50%乙醇代替樣品的乙醇溶液，其吸光度記為A對(duì)照;再做空白對(duì)照，即用40 μL PBS 代替底物AChI，記為A空白。在405 nm 下測(cè)量吸光值并根據(jù)下式計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=［A對(duì)照-(A樣品-A空白)］/A對(duì)照×100

式中，A對(duì)照為用50%乙醇溶液代替樣品溶液時(shí)的吸光值;A樣品為添加樣品溶液時(shí)的吸光值;A空白為添加樣品溶液但沒(méi)有添加底物AChI(用40 μL PBS代替底物AChI)時(shí)的吸光值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，陽(yáng)性對(duì)照為毒扁豆堿。

2 結(jié)果與討論

2.1 中藥提取物的AChE 抑制活性

按照1.3 樣品溶液的制備方法提取制備中草藥樣品，采用改良的基于Ellman 法的微量篩選模型，按照1.5 中草藥粗提物的乙酰膽堿酯酶抑制活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)所述條件進(jìn)行。根據(jù)測(cè)得各對(duì)照品、樣品、樣品空白的吸光度，按照1.6 所述抑制率計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，得到48 種中草藥不同極性溶劑提取物在實(shí)驗(yàn)體系中高、低兩種終濃度(76.92，3.85 mg/L)的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 中藥提取物的AChE 抑制活性Table 1 AChE inhibitory activity of different traditional Chinese medicine extracts

注:毒扁豆堿在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為7.69×10-2 mg/L、3.85 mg/L 時(shí)的抑制率分別為57.22±0.04%、88.85±0.01%。Note:when the final concentrations of eserine in the experimental system were 7.69×10-2 mg/L and 3.85 mg/L，the inhibitory rates were 57.22±0.04%and 88.85±0.01%，respectively.

從表1 中可以看出，當(dāng)提取物在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為76.92 mg/L 時(shí)，黃柏80%乙醇提取物、元胡80%乙醇提取物、丹參乙酸乙酯提取物AChE 抑制率較高，其值均在45%以上。其中，黃柏80%乙醇提取物抑制率最高，其值為66.72±0.02%。而且，這三種中藥提取物的抑制率與終濃度為7.69×10-2mg/L 毒扁豆堿的乙酰膽堿酯酶抑制率(57.22±0.04%)較為接近。另外，部分藥材不同極性溶劑提取物對(duì)AChE 抑制率為負(fù)值。如:當(dāng)提取物在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為76.92 mg/L 時(shí)，柏子仁乙酸乙酯提取物的AChE 抑制率為-8.63±-0.10%、五味子80%乙醇提取物的AChE 抑制率為-7.92±-0.20%。這在蕨類(lèi)植物和海藻提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性研究中也有類(lèi)似現(xiàn)象［11，12］。

2.2 提取溶劑的影響

本研究選擇4 種不同極性提取溶劑(水、80%乙醇、乙酸乙酯、石油醚)提取制備中草藥樣品。根據(jù)表1 數(shù)據(jù)，對(duì)比提取溶劑與提取物抑制率的關(guān)系，可以看出有以下規(guī)律特征:

首先，少數(shù)中藥材不同極性溶劑提取物具有一定的AChE 抑制活性。如:黃柏水提取物的抑制率為42.08±0.02%(76.92 mg/L)、80%乙醇提取物的抑制率為66.72±0.02%(76.92 mg/L);丹參乙酸乙酯提取物的抑制率為46.84±0.03%(76.92 mg/L)、石油醚提取物的抑制率為46.28±0.06%(76.92 mg/L)。

其次，同一藥材的不同極性溶劑提取物的AChE 抑制活性可能相差較大。如:當(dāng)提取物在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為76.92 mg/L 時(shí)，元胡80%乙醇提取物抑制率為52.67±0.04%，而同濃度下其石油醚提取物抑制率僅為3.27±0.48%。這可能與不同極性提取溶劑所提取的化合物種類(lèi)及含量均有不同有關(guān)。

第三，幾種不同品種中藥材的同一極性溶劑提取物均具有較好的AChE 抑制活性。這可能是因這幾種中藥材的同一極性溶劑提取物所含化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類(lèi)型相似所致。如:當(dāng)提取物在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為76.92 mg/L 時(shí)，黃柏、元胡80%乙醇提取物均有較強(qiáng)的AChE 抑制活性，其所含化學(xué)成分主要是生物堿類(lèi)化合物［13，14］。

參考相關(guān)文獻(xiàn)可知，已發(fā)現(xiàn)的具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化合物種類(lèi)較多、極性差異大［13，14］。這與本研究的結(jié)果一致，說(shuō)明中草藥中不同極性和結(jié)構(gòu)類(lèi)型的化合物均有可能具有乙酰膽堿酯酶抑制活性，選擇適當(dāng)極性的提取溶劑對(duì)中草藥樣品進(jìn)行有效提取，是準(zhǔn)確快速的發(fā)現(xiàn)AChEI 的前提和保障。

2.3 提取物濃度的影響

中草藥提取物濃度對(duì)酶的抑制活性也有一定影響。提取物濃度太高，基質(zhì)對(duì)酶活性的影響會(huì)增強(qiáng);提取物濃度太低，其中所含活性成分含量相應(yīng)減少，又會(huì)造成對(duì)酶的抑制效果不明顯，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。本研究選取中草藥粗提物在實(shí)驗(yàn)體系中高、低兩種終濃度(76.92 mg/L 和3.85 mg/L)用于AChE 抑制活性研究。

從表1 可以看出，當(dāng)中藥提取物在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為3.85 mg/L 時(shí)，多數(shù)中藥提取物的AChE抑制率較低，其值一般在10%以下。

當(dāng)提取物在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為76.92 mg/L時(shí)，具有乙酰膽堿酯酶抑制性的中藥提取物其大多數(shù)AChE 抑制率較高，如:黃柏水提取物的AChE 抑制率從3.08±0.13%(3.85 mg/L)變?yōu)?2.08±0.02%(76.92 mg/L);少數(shù)中藥提取物對(duì)AChE 抑制活性表現(xiàn)出減弱趨勢(shì)，如:五味子石油醚提取物AChE 抑制率從終濃度3.85 mg/L 時(shí)的25.45±1.96%變?yōu)榻K濃度76.92 mg/L 時(shí)的3.26±0.43%。

2.4 中藥提取物IC50值的測(cè)定

選取對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性明顯的黃柏80%乙醇提取物，元胡80%乙醇提取物，丹參乙酸乙酯提取物，精密吸取上述提取物儲(chǔ)備液，用50%乙醇稀釋成八個(gè)濃度梯度(50～2000 mg/L)，采用改良的Ellman 法微量篩選模型，按照1.5 中草藥粗提物的乙酰膽堿酯酶抑制活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)所述條件進(jìn)行。根據(jù)測(cè)得各對(duì)照品、樣品、樣品空白的吸光度，按照1.6 所述抑制率計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，得到上述中草藥不同溶劑提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性，計(jì)算IC50(mg/L)值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三種中草藥提取物的乙酰膽堿酯酶抑制作用(n=3)Table 2 Acetylcholinesterase inhibitory activities of 3 TCM extracts(n=3)

由表2 可知，黃柏80%乙醇提取物，元胡80%乙醇提取物，丹參乙酸乙酯提取物的IC50值分別為295.12、229.09、1202.26 mg/L。其中，元胡80%乙醇提取物的IC50值最低，黃柏80%乙醇提取物的IC50值次之，丹參乙酸乙酯提取物的IC50值最大。三種中草藥提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶活性有一定抑制作用，但與陽(yáng)性對(duì)照品毒扁豆堿IC50值有一定差距，這可能與提取物中具有AChE 抑制活性的有效成分含量較低或者提取物的基質(zhì)成分復(fù)雜有關(guān)?；钚猿煞肿粉櫤Y選和分離純化工作有待于進(jìn)一步進(jìn)行。

3 結(jié)論

采用基于酶標(biāo)儀的微量篩選模型對(duì)48 種中藥不同極性溶劑提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)提取物在實(shí)驗(yàn)體系中終濃度為76.92 mg/L 時(shí)，黃柏80%乙醇提取物、元胡80%乙醇提取物和丹參乙酸乙酯提取物的AChE 抑制活性較高，其IC50值分別為295.12、229.09、1202.26 mg/L。另外，提取物濃度對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性有一定影響。本研究結(jié)果為從中草藥中快速篩選潛在的乙酰膽堿酯酶抑制劑提供了方法和數(shù)據(jù)支持。

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