楊小青 宋金春 謝順嵐 郝好華

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部袁湖北武漢430060曰2.武漢大學(xué)藥學(xué)院袁湖北武漢430072

不同提取方法蓮子心總生物堿抗氧化活性比較

楊小青1宋金春1謝順嵐2郝好華1

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部袁湖北武漢430060曰2.武漢大學(xué)藥學(xué)院袁湖北武漢430072

目的比較不同提取方法蓮子心總生物堿的抗氧化活性袁并以此為指標(biāo)評(píng)價(jià)提取工藝。方法采用回流提取堯超聲提取堯浸漬提取法提取蓮子心中總生物堿袁并比較3種提取物的體外抗氧化活性。結(jié)果總生物堿提取率院回流提取[(1.03依0.01)%]躍超聲提取[(0.92依0.01)%]躍浸漬提取法[(0.89依0.02)%]曰主要成分總生物堿含量院超聲提取法躍回流提取法躍浸漬提取法袁1袁1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)堯2袁2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)堯羥基(窯OH)自由基清除活性院回流提取躍超聲提取躍浸漬提取法袁超氧陰離子活性院超聲提取法躍回流提取法躍浸漬提取法。結(jié)論回流提取法具有最高的提取率袁以及強(qiáng)抗氧化活性袁為最佳提取方法。

蓮子心；總生物堿；提取方法；抗氧化

蓮子心是睡蓮科蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)的成熟種仁。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道可知袁其在我國(guó)已具有兩千多年的栽種歷史袁尤其在湖南堯湖北堯江蘇堯福建堯浙江等地被廣泛種植[1]。在日常生活中袁蓮子心可作為茶飲料袁具有清心火堯止遺精之功效[2]袁同時(shí)也被用作觀賞植物。自1962年研究者首次從蓮中分離出生物堿袁由于其廣泛的藥理活性[3-5]袁如抗HIV堯抗高血脂堯抗血小板聚集堯降血壓堯抗氧化堯抗菌堯抗肥胖堯抗糖尿病以及抑制黑色素生成活性袁蓮子心生物堿受到眾多研究者青睞。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的不斷加快袁環(huán)境污染堯放射線輻射等外界因素導(dǎo)致人體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基。研究證實(shí)袁機(jī)體衰老堯癌癥等重大疾病的產(chǎn)生都與體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量自由基相關(guān)[6]。而目前市場(chǎng)上多采用化學(xué)合成的抗氧化劑對(duì)人體具有較強(qiáng)的毒副作用[7]袁因此袁著手尋找一種天然抗氧化劑不僅可以解決過(guò)氧化對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的危害袁還能減少抗氧化劑自身對(duì)人體的毒副作用。本研究采用熱回流堯超聲以及冷浸3種不同提取方法得到蓮子心總生物堿袁在比較提取率的基礎(chǔ)上袁比較3種不同方法得到的提取物體外抗氧化活性的能力袁兩者結(jié)合作為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

SK5200H型超聲波清洗器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)袁UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)袁RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)袁精密恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)袁XW-80A型漩渦混合器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)袁YXJ-1型高速離心機(jī)(深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 主要化學(xué)試劑

丁羥甲苯(BHT袁含量為99.0%)袁硫代巴比妥酸(TBA)袁ABTS[2,2'-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基]袁DPPH(1袁1-二苯基-2-苦肼基自由基)袁福林酚試劑(Folin-Ciocalteu's reagent)袁購(gòu)于Sigma公司曰過(guò)硫酸鉀袁30%雙氧水袁三氯甲烷袁鐵氰化鉀袁三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)袁氯化亞鐵袁焦性沒(méi)食子酸袁三氯乙酸(TCA)袁2-脫氧核糖袁抗壞血酸(VC袁含量為99.7%)袁乙二胺四乙酸二鈉袁購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司曰沒(méi)食子酸對(duì)照品袁購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所袁含量為89.9%。

1.3 植物材料

蓮子心袁購(gòu)于湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司袁產(chǎn)地為湖北洪湖袁生產(chǎn)批號(hào)院20140101。

1.4 方法

1.4.1 蓮子心中總生物堿的提取

蓮子心磨成粗粉袁過(guò)400目篩袁真空干燥袁分別采用回流提取法堯超聲提取法堯浸漬提取法進(jìn)行提取。

1.4.1.1 回流提取法稱取蓮子心粗粉100 g袁置于1000 mL圓底燒瓶中加入70%乙醇(固液比1頤3)袁回流3次袁每次1 h袁趁熱過(guò)濾合并濾液袁減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇袁浸膏溶液加1%鹽酸調(diào)至pH 1~2袁過(guò)濾袁濾液用1%氨水調(diào)至pH 9~10袁用等體積氯仿萃取2次袁分液合并氯仿層袁用無(wú)水硫酸鈉脫水袁過(guò)濾袁減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收氯仿得浸膏袁用1%鹽酸溶解后轉(zhuǎn)移到燒杯中袁再用1%氨水調(diào)至pH 9~10析出沉淀袁加水至300mL左右靜置袁用砂芯漏斗過(guò)濾得沉淀袁冷凍干燥得蓮心總堿粉末。

1.4.1.2 超聲提取法稱取蓮子心粗粉100 g袁置于1000 mL燒杯中加入70%乙醇(固液比1頤3)袁封口超聲提取3次袁每次45min袁過(guò)濾之后合并濾液袁余下步驟及條件均同回流提取法。

1.4.1.3 浸漬提取法稱取蓮子心粗粉100 g袁置于1000 mL燒杯中加入70%乙醇(固液比1頤3)袁封口浸漬3次袁每次8 h袁過(guò)濾合并濾液袁余下步驟同上。

1.4.2 蓮子心不同提取方法所得提取液中總生物堿含量測(cè)定

精密稱取蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品5 mg袁無(wú)水乙醇溶解袁冷卻至室溫袁并定容至25 mL袁振蕩搖勻袁得濃度為200滋g/mL的蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0堯1.5堯2.0堯2.5堯3.0堯3.5堯4.0 mL袁分別置于7支10 mL容量瓶中袁用無(wú)水乙醇稀釋至刻度袁振蕩搖勻。靜置10min后于282 nm處測(cè)量吸光度袁用無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照袁以蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)袁吸光度為縱坐標(biāo)袁計(jì)算線性回歸方程。

準(zhǔn)確稱取野1.4.1冶中干燥粉末各10mg袁置于250mL容量瓶中袁無(wú)水乙醇溶解袁并定容到刻度線袁按上述實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定吸光度袁每種提取液平行測(cè)三組袁根據(jù)蓮心堿高氯酸鹽對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算各提取液中總生物堿含量(%)。

1.4.3 蓮子心不同提取方法所得提取液中總酚含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu比色法[8]測(cè)定蓮子心提取物中總酚的含量。精密稱取沒(méi)食子酸11.12mg袁加水溶解并定容至25 mL袁得濃度為0.4 mg/m L的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液50堯100堯200堯300堯400堯500堯600滋L于25mL容量瓶中袁加蒸餾水6mL袁福林酚試劑0.5 mL袁在0.5~8 min內(nèi)加入1.5 mL 20% Na2CO3袁充分混勻后袁加水定容至刻度袁在30益下避光反應(yīng)30min袁以6.0mL蒸餾水代替對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照袁于波長(zhǎng)760 nm測(cè)定吸光度袁繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品總酚含量測(cè)定院精密稱取野1.4.1冶中各干燥粉末20mg配制成400滋g/mL溶液袁吸取200滋L樣品于25 m L棕色瓶中袁按上述方法測(cè)定吸光值袁代入公式得沒(méi)食子酸當(dāng)量。

1.4.4 體外抗氧化活性檢測(cè)

1.4.4.1 DPPH自由基清除測(cè)試一定濃度范圍的蓮子心乙醇提取物0.3 mL分別加入2.7 m L的0.2 mmol/L DPPH(用無(wú)水乙醇溶解)袁渦旋混勻后袁將配好的樣品避光靜置1 h后在517 nm處測(cè)其吸光度。同樣的方法以1mL無(wú)水乙醇代替提取物作為空白對(duì)照袁同樣濃度范圍的BHT堯VC作為陽(yáng)性對(duì)照[8]。

其中袁A玉表示空白對(duì)照DPPH的吸光度袁As表示待測(cè)樣品DPPH吸光度。

1.4.4.2 ABTS自由基清除試驗(yàn)7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L的K2S2O8以9頤1(V/V)比例混合袁室溫下靜置16 h袁使用前稀釋8倍作為ABTS儲(chǔ)備液。一系列濃度范圍的蓮子心乙醇提取物(1.0 mL)中分別加入2.5mL ABTS儲(chǔ)備液袁混勻后避光反應(yīng)20min并于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以1 mL蒸餾水加ABTS待用混合液作為空白對(duì)照袁VC堯BHT作為陽(yáng)性對(duì)照[9]。

ABTS清除率(%)=[(A玉-As)/A玉]伊100%

其中袁A玉表示空白對(duì)照ABTS的吸光度袁As表示待測(cè)樣品ABTS吸光度。

1.4.4.3 羥基自由基清除反應(yīng)體系中分別加入10mmol/L的2-脫氧核糖400滋L堯FeCl3窯6H2O(10mmol/L)100滋L堯EDTA-2Na(1mmol/L)100滋L堯H2O2(10mmol/L)100滋L堯樣品(10~100滋g/mL)100滋L袁再加入VC(1 mmol/L) 200滋L引發(fā)反應(yīng)袁在37益下反應(yīng)1 h袁加入1 mL 0.5%TBA的NaOH(0.025 mol/L)溶液和1 mL 30% TCA水溶液袁混合物80益水浴加熱30 min袁冷卻。在532 nm處測(cè)定吸光度值(As)袁以0.05mol/L PBS(pH 7.4)在反應(yīng)體系中代替樣品作為空白對(duì)照測(cè)得吸光度值(A玉)袁平行測(cè)定三組袁計(jì)算吸光度平均值袁計(jì)算清除率袁同濃度范圍的BHT作為陽(yáng)性對(duì)照[10]。

羥基自由基清除率(%)=[(A玉-As)/A玉]伊100%

其中袁AI表示空白對(duì)照羥基自由基的吸光度袁AS表示待測(cè)樣品羥基自由基的吸光度。

1.4.4.4 超氧陰離子自由基清除1 mL 200滋g/mL待測(cè)樣品加入4.5 mL(pH 8.2袁0.05 mol/L)Tris-HCl緩沖液在25益下反應(yīng)10min袁加入600滋L 0.003mol/L鄰苯三酚(用10mmol/L鹽酸溶解)袁充分反應(yīng)后立即在325 nm處測(cè)定吸光度袁每隔30 s測(cè)定1次吸光度袁直至吸光值不再發(fā)生明顯變化袁空白對(duì)照用10mmol/L鹽酸代替樣品袁BHT用作陽(yáng)性對(duì)照。平行測(cè)定三組袁鄰苯三酚的自氧化速率可以根據(jù)吸光度-時(shí)間曲線計(jì)算斜率袁得出斜率平均值[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析袁正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示袁多組間比較采用方差分析袁兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同提取方法所得蓮子心提取物提取率

回流提取堯超聲提取堯浸漬提取3種方法所得蓮子心乙醇提取物干燥粉末重量見(jiàn)表1。

表1 蓮子心不同提取方法所得提取物的提取率(±s)

表1 蓮子心不同提取方法所得提取物的提取率(±s)

注院與回流提取法比較袁*P<0.05

?

2.2 蓮子心乙醇提取物中總生物堿含量

采用紫外分光光度法檢測(cè)提取液中總生物堿含量袁根據(jù)總生物堿在282 nm處的特征吸收峰袁得到線性回歸方程院y=0.0139x-0.0339袁R2=0.9999袁計(jì)算出不同提取方法中所得的總生物堿濃度見(jiàn)表2。

表2 蓮子心不同提取方法所得提取液中總生物堿的含量(±s)

表2 蓮子心不同提取方法所得提取液中總生物堿的含量(±s)

注院與超聲提取法比較袁*P<0.05

?

2.3 蓮子心乙醇提取物中總酚含量

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為院y=0.099 047x+ 0.039 14袁R2=0.998袁計(jì)算三種提取方法中總酚含量袁結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蓮子心不同提取方法所得提取液中總酚的含量(±s)

表3 蓮子心不同提取方法所得提取液中總酚的含量(±s)

注院與回流提取法比較袁*P<0.05

?

2.4 體外抗氧化活性比較

2.4.1 DPPH自由基清除率比較

回流提取堯超聲提取堯浸漬提取法所得蓮子心乙醇提取物在2.70~48.65滋g/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基具有良好的清除作用袁且具有明顯的濃度依賴性(圖1)袁VC堯BHT以及3種提取物對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率(IC50)見(jiàn)表4。

圖1 VC、BHT及3種不同提取方法所得提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.4.2 ABTS自由基清除率比較

在1.43~25.70滋g/mL范圍內(nèi)袁3種不同提取方法所得蓮子心乙醇提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用袁與VC堯BHT比較結(jié)果見(jiàn)圖2袁IC50值見(jiàn)表4。

2.4.3 羥基自由基清除率比較

3種不同提取方法所得蓮子心乙醇提取物對(duì)羥

表4 蓮子心不同提取方法所得提取物自由基清除IC50值

圖2 VC、BHT及3種不同提取方法所得提取物對(duì)ABTS自由基的清除作用

基自由基的清除作用見(jiàn)圖3。以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照袁通過(guò)對(duì)清除率分析以及曲線擬合得到IC50值見(jiàn)表4。

圖3 BHT和3種不同方法所得提取物對(duì)羥基自由基的清除作用

2.4.4 超氧陰離子清除率比較

采用鄰苯三酚自氧化體系比較3種不同方法得到的蓮子心提取物對(duì)超氧陰離子自氧化的抑制作用比較見(jiàn)圖4。BHT作為陽(yáng)性對(duì)照袁4種藥物作用于鄰苯三酚體系其自氧化速率見(jiàn)表4。

3 討論

蓮子心乙醇提取物中總生物堿具有多種成分袁主要活性成分為蓮心堿堯甲基蓮心堿堯異蓮心堿堯荷葉堿等[12]。袁小紅[13]以總生物堿含量堯干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)袁對(duì)水提法堯水提醇沉法堯半仿生提取法堯半仿生提取醇沉法四種方法進(jìn)行比較袁提出以半仿生提取法為最佳。鐘姣姣等[14]以蓮子心為原料袁用微波輔助醇提水沉法提取總生物堿袁采用正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝袁在微波功率400W袁微波時(shí)間5min袁料液比1頤30(g頤mL),乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的條件下可使蓮子心總生物堿的提取率達(dá)到2.99%。

圖4 BHT和3種不同方法所得提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

本實(shí)驗(yàn)中3種提取方法所得蓮子心乙醇提取物的干燥粉末院回流提取法躍超聲提取法躍浸漬提取法。對(duì)其提取物的成分分析袁主要成分為總生物堿袁以及少量總酚袁總生物堿的含量院超聲提取法躍回流提取法躍浸漬提取法曰總酚的含量院回流提取法躍超聲提取法躍浸漬提取法。有文獻(xiàn)報(bào)道袁蓮子心總生物堿遇光和熱不穩(wěn)定袁可能是回流提取法中總生物堿的含量低于超聲提取法的原因[15]。

抗壞血酸堯BHT是文獻(xiàn)報(bào)道中常見(jiàn)的具有很好抗氧化活性的物質(zhì)[16]袁在本研究中作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基的醇溶液呈紫色袁在517 nm處有吸收袁DPPH在反應(yīng)體系中提供單電子袁一旦抗氧化劑接受單電子袁其吸收逐漸消失袁且抗氧化性越強(qiáng)袁褪色程度越深[17]。從圖1中可以看出袁3種提取方法得到的提取物都具有一定的DPPH自由基清除能力袁并且在一定濃度范圍內(nèi)袁具有濃度依賴性袁與陽(yáng)性對(duì)照相比具有顯著性差異袁三種提取方法之間的IC50值有細(xì)微差異袁其中回流提取得到的提取物DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。在ABTS反應(yīng)體系中袁ABTS被氧化成藍(lán)綠色的ABTS水溶性自由基袁抗氧化劑與ABTS自由基反應(yīng)后使溶液褪色袁特征吸光度降低袁吸光度越低袁表明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[18]。從圖2可以看出袁在ABTS測(cè)試中袁3種提取方法的提取物與VC和BHT清除ABTS自由基能力的差異顯著袁但是3種提取方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)袁3種提取方法得到提取液的半數(shù)清除率相近。本研究采用Fe3+-EDTA-抗壞血酸-過(guò)氧化氫體系產(chǎn)生羥基自由基袁脫氧核糖受羥基自由基進(jìn)攻后裂解袁在酸性堯加熱的條件下與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅色化合物袁抗氧化劑的存在可阻止羥基自由基攻擊脫氧核糖[19]。根據(jù)圖3可看出袁3種提取方法對(duì)羥基自由基具有不同的清除效率袁并且其半數(shù)清除率均明顯高于BHT袁且回流提取物具有最強(qiáng)的清除能力(以IC50值比較)。本研究采用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法評(píng)價(jià)3種不同提取方法所得總生物堿對(duì)超氧陰離子自氧化的抑制作用[20]袁根據(jù)圖4袁3種方法得到的提取物的自氧化速率與陽(yáng)性對(duì)照BHT相近袁浸漬提取物躍回流提取物躍超聲提取物袁說(shuō)明對(duì)超氧陰離子自氧化的抑制作用院浸漬提取法約回流提取法約超聲提取法。

綜上所述袁本實(shí)驗(yàn)采用提取率堯體外抗氧化活性能力為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)3種方法中蓮子心中的總生物堿袁其可避免單因素誤差袁而且根據(jù)其功效作為評(píng)價(jià)指標(biāo)可以提高蓮子心乙醇提取物的利用率?；亓魈崛》ㄊ亲钸m合提取蓮子心中有效成分的方法袁此方法不僅操作簡(jiǎn)單堯方法穩(wěn)定袁而且所得提取物具有很強(qiáng)的DPPH堯ABTS堯羥基自由基堯超氧陰離子清除活性袁表現(xiàn)強(qiáng)的抗氧化活性。

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Com parison of antioxidant activity of the total alkaloids in lotus p lumule by different extraction m ethods

YANG Xiaoqing1SONG Jinchun1XIE Shunlan2HAOHaohua1
1.Department,Pharmacy,Renmin Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China;2.Pharma鄄ceutical College ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430072,China

Ob jective To compare the antioxidant activity of the total alkaloids in lotus plumule and to choose the best extraction technology of lotus plumule using different extractionmethods.Methods Reflux extraction,ultrasonic extrac鄄tion,dipping extraction method were used to extract total alkaloids in lotus and the antioxidant activity were used as a significant index to compare.Results The extraction rate:reflux extraction[(1.03依0.01)%]>ultrasonic extraction [(0.92依0.01)%]>dipping extraction[(0.89依0.02)%],themain component of total alkaloid content:ultrasonic extraction >reflux extraction>dipping extraction method,DPPH,ABTS,窯OH radical scavenging activity:reflux extraction>ul鄄trasonic extraction>dipping extraction method,superoxide anion:ultrasonic extraction>reflux extraction>dipping extraction.Conclusion Reflux extraction has the highest extraction rate,aswell as strong antioxidant activity,which is proved to be the best extractionmethod.

Lotus plumule;Total alkaloids;Extractionmethods;Antioxidant activity

R285

A[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]1673-7210（2015）06（c）-0100-05

院2015-01-05本文編輯院蘇暢)

楊小青(1990-)袁女袁武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院藥劑學(xué)專業(yè)2013級(jí)在讀碩士研究生曰研究方向院臨床藥學(xué)。

宋金春(1964-)袁男袁博士袁主任藥師袁教授袁碩士研究生導(dǎo)師曰研究方向院臨床藥學(xué)。