張婷婷，梁國(guó)標(biāo)，蘇靜緣，郭冰玉，王楷文，李曉明

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熊果酸對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷的影響

張婷婷，梁國(guó)標(biāo)，蘇靜緣，郭冰玉，王楷文，李曉明*

目的 探討熊果酸對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)后早期腦損傷的保護(hù)作用。方法 48只成年雄性SD大鼠分成4組(假手術(shù)組、模型組、低劑量給藥組、高劑量給藥組)，每組12只。采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立大鼠SAH模型，造模后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分；造模后72 h檢測(cè)腦含水量、腦血管通透性；造模后72 h檢測(cè)血清中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性。結(jié)果 熊果酸給藥可有效改善SAH大鼠的神經(jīng)功能缺損(P<0.05)；降低腦含水量和腦血管通透性(P<0.05)；降低血清MDA含量(P<0.05)；增強(qiáng)SOD和GSH-Px活性(P<0.05)。結(jié)論 熊果酸對(duì)SAH后早期腦損傷有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高腦組織抗氧化能力有關(guān)。

熊果酸；蛛網(wǎng)膜下腔出血；早期腦損傷；抗氧化

0 引言

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)具有高致死率和致殘率［1］。在中國(guó)，一項(xiàng)針對(duì)226名SAH患者粗略的年發(fā)病率統(tǒng)計(jì)表明，男性發(fā)病率為6.2%，女性發(fā)病率為8.2%［2］。早期研究指出，氧化應(yīng)激對(duì)SAH后早期腦損傷(Early brain injury，EBI)的發(fā)病機(jī)制起著重要作用，現(xiàn)已成為治療SAH的有效治療策略。熊果酸(Ursolic acid)又名烏索酸，是廣泛存在于天然植物和草藥中的五環(huán)三萜類化合物［3］，具有降糖、降血脂、護(hù)肝、抗炎、抗癌、抗氧化和抗病毒等多種生物學(xué)活性［4-5］。在體和體外研究均表明，熊果酸可以治療氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的損害，但熊果酸對(duì)SAH是否具有保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討熊果酸對(duì)SAH后EBI的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 SD雄性大鼠48只，體重250～350 g，大鼠購(gòu)自解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。受試藥物：熊果酸(純度>98%)購(gòu)自天津士蘭科技有限公司，批號(hào)：20130321，1%吐溫-80溶解。丙二醛(Methane Dicarboxylic Aldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathionperoxidase，GSH-Px)試劑盒由南京建成生物工程公司購(gòu)得。

1.2 模型建立與分組

1.2.1 頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立SAH模型 術(shù)前10%水合氯醛(4.0 mL/kg)腹腔注射麻醉，頸部腹側(cè)正中縱行切口，解剖大鼠頸動(dòng)脈鞘，分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，并以動(dòng)脈夾臨時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈殘端以顯微剪刀剪小口，魚(yú)線(直徑0.261 mm)送入頸外動(dòng)脈，解除頸內(nèi)動(dòng)脈臨時(shí)血管夾，將尼龍線沿頸內(nèi)動(dòng)脈送入2 cm，有阻力后繼續(xù)送入，待有突破感再送入2 mm，解除頸總動(dòng)脈阻斷夾后回撤魚(yú)線，結(jié)扎頸外動(dòng)脈［6］，如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡需繼續(xù)制作模型補(bǔ)足數(shù)量。以穿刺頸外動(dòng)脈魚(yú)線送入頸內(nèi)動(dòng)脈未刺破血管的大鼠作為對(duì)照組。

1.2.2 分組及給藥 48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、低劑量熊果酸組(25 mg/kg)、高劑量熊果酸組(50 mg/kg)。分別在制成模型后0.5、24、48、71 h各給藥1次，第3天給藥1 h后進(jìn)行取材。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 于造模后24 h對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，評(píng)分參照Sugawara［7］的方法，見(jiàn)表1。

表1 SAH后神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

測(cè)試得分01231.籠內(nèi)5min自發(fā)性運(yùn)動(dòng)不運(yùn)動(dòng)很少移動(dòng)位置移動(dòng)但不超過(guò)籠內(nèi)3條邊移動(dòng)且至少超過(guò)籠內(nèi)3條邊2.四肢自發(fā)性移動(dòng)不移動(dòng)四肢輕微移動(dòng)四肢移動(dòng)但緩慢四肢如同模型前一樣移動(dòng)3.拽尾時(shí)前肢伸展不伸展輕微伸展伸展受限且少于模型前如模型前一樣伸展4.爬行金屬籠壁不能攀爬微弱爬行正常爬行5.雙側(cè)軀干對(duì)碰觸的反應(yīng)無(wú)反應(yīng)弱反應(yīng)正常反應(yīng)6.觸須反應(yīng)無(wú)反應(yīng)弱反應(yīng)正常反應(yīng)

1.4 腦血管通透性測(cè)定 每組動(dòng)物各取6只。于末次給藥后股動(dòng)脈給予2%伊文斯蘭溶液(5 mL/kg)，全身循環(huán)1 h，心室內(nèi)灌注生理鹽水，快速移除腦，對(duì)整腦進(jìn)行稱重，按10 mL/g的體積浸入到甲酰胺溶液中，60 ℃水浴48 h，待色素浸出后，取浸出液620 nm處紫外分光光度儀測(cè)OD值。

1.5 腦組織含水量測(cè)定 每組動(dòng)物各取6只。造模后72 h后，腹主動(dòng)脈取血用于試劑盒檢測(cè)，腦部用于含水量的測(cè)定。用濾紙小心拭去表面血跡，在1/1 000 g電子分析天平上精確稱出濕重后，放入110 ℃電烤箱內(nèi)烘干72 h至恒重。然后用電子分析天平精確稱出干重。按照Elliott公式計(jì)算腦含水率：腦含水率(%)=［(濕重-干重)/濕重］×100%。

1.6 大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px活性測(cè)定 腹主動(dòng)脈取血4 mL，取血后室溫靜置1 h，然后以3 000r/min離心10 min，分離血清，置-20 ℃冰箱凍存，用比色法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MDA含量，以及SOD和GSH-Px活性。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)SAH大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響 模型組大鼠經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺后，動(dòng)物均出現(xiàn)了神經(jīng)缺損癥狀。行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2，分值3～18分，分值越低表明神經(jīng)缺損癥狀越嚴(yán)重，反之亦然。此實(shí)驗(yàn)中，模型組較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損現(xiàn)象(P<0.01)，熊果酸給藥可改善大鼠的神經(jīng)功能(P<0.05)，尤其是高劑量給藥組(P<0.01)。

表2 熊果酸對(duì)SAH大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(n=12)

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

2.2 熊果酸對(duì)SAH大鼠腦含水量和腦血管通透性的影響 大鼠經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺損傷后，較假手術(shù)組腦含水量明顯增加(P<0.01)，腦血管通透性明顯增強(qiáng)(P<0.01)，熊果酸給藥均可降低腦含水量和腦內(nèi)伊文斯蘭的含量(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 熊果酸對(duì)SAH大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的影響 大鼠經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺損傷后，血清中MDA含量增加，SOD和GSH-Px活性降低，給藥組較模型組指標(biāo)改善明顯(P<0.05)，高劑量給藥組在SAH 72 h后，GSH-Px活性明顯高于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 熊果酸對(duì)SAH大鼠腦組織含水量及腦血管
通透性的影響(n=6)

注：與假手術(shù)組比較,**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

表4 熊果酸對(duì)SAH大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的影響(n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量給藥組比較，&P<0.05

3 討論

SAH后引起的病理生理學(xué)機(jī)制改變十分復(fù)雜，包括腦水腫、血-腦屏障破壞以及血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔后導(dǎo)致的顱內(nèi)壓增高等引起的腦灌注壓下降，進(jìn)而因腦血液供應(yīng)減少造成急性缺血性腦損害，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死及凋亡［8-9］。EBI可能是SAH患者高死亡率的首要原因。EBI是指SAH后72 h以內(nèi)整個(gè)腦組織發(fā)生的直接損傷［10］，涉及腦血管痙攣發(fā)生之前腦組織內(nèi)(包括腦組織細(xì)胞凋亡在內(nèi))的多種病理生理事件。目前EBI的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

氧自由基在SAH腦損傷中起著重要作用［11-12］。MDA為氧自由基攻擊生物膜形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物。MDA可進(jìn)一步交聯(lián)蛋白質(zhì)和磷脂上的氨基，降低膜流動(dòng)性，致細(xì)胞變形，功能受損，其含量是反映氧自由基水平的重要指標(biāo)。SOD是體內(nèi)主要的自由基清除酶，可催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫和氧，超氧陰離子的產(chǎn)生是其他自由基產(chǎn)生和增殖的關(guān)鍵步驟，SOD是反映機(jī)體內(nèi)源性抗氧化能力的重要指標(biāo)。理論上SOD能夠清除氧自由基，保護(hù)生物免受自由基的攻擊傷害。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，在細(xì)胞內(nèi)能清除過(guò)氧化物代謝產(chǎn)物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整，具有清除自由基，切斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)的作用，尤其在防止脂質(zhì)過(guò)氧化方面起重要作用［13］。

國(guó)內(nèi)外資料均顯示，熊果酸具有顯著的抗氧化作用，有研究表明，熊果酸可逆轉(zhuǎn)肝損傷大鼠氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等的活性，熊果酸給藥組大鼠腦含水量和腦中伊文斯蘭含量低于模型組，表明熊果酸可減輕SAH后腦水腫及腦血管的通透性，熊果酸給藥還可明顯改善大鼠的神經(jīng)行為缺損，表明熊果酸給藥可緩解SAH后EBI癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中MDA含量高于假手術(shù)組，SOD和GSH-Px活性低于假手術(shù)組，表明SAH發(fā)病過(guò)程中MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，而熊果酸給藥對(duì)SAH后氧自由基的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。另外，以往體內(nèi)及體外的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氧化應(yīng)激在血腦屏障破壞發(fā)生之后與腦水腫密切相關(guān)。熊果酸給藥后，可明顯減輕腦水腫及血腦屏障的破壞程度。以上結(jié)果表明，熊果酸作為抗氧化劑，對(duì)抑制腦水腫起到重要作用，熊果酸可能通過(guò)增加抗氧化酶的含量，提高機(jī)體的抗氧化能力，清除自由基，從而減少腦細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

綜上所述，熊果酸可通過(guò)清除氧自由基、減輕腦水腫和腦血管通透性，對(duì)SAH后大鼠腦組織發(fā)揮保護(hù)作用，然而，SAH繼發(fā)性腦損害是多因素共同作用的結(jié)果，熊果酸的確切作用尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effects of ursolic acid on early brain injury after subarachnoid hemorrhage in rats

ZHANG Ting-ting,LIANG Guo-biao,SU Jing-yuan,GUO Bing-yu,WANG Kai-wen,LI Xiao-ming*

(Department of Neurosurgery,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the effects of ursolic acid (UA) on early brain injury following subarachnoid hemorrhage (SAH).Methods 48 male SD rats were divided into vehicle-treated sham,vehicle-treated SAH,and UA-treated SAH groups.The endovascular puncture model was used to induce SAH.Neurological score was evaluated at 24 h after SAH,brain water content and blood-brain barrier(BBB) permeability were measured at 72 h after SAH.The levels of serum superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde(MDA) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were determined by diagnostic kit.Results UA administration could significantly improve neurological scores (P<0.05),reduce brain water content and BBB permeability (P<0.05),decrease the serum level of MDA (P<0.05),increase the level of SOD and GSH-Px (P<0.05).Conclusion UA could protect against EBI following SAH and its mechanism maybe partly attribute to its antioxidant property.

Ursolic acid;Subarachnoid hemorrhage;Early brain injury;Anti-oxidative

2015-03-11

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110016

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201509002