史國生， 林永強， 徐麗華， 郭東曉

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南250101)

銀黃顆粒由金銀花提取物和黃芩提取物組成，清熱疏風(fēng)、利咽解毒。用于外感風(fēng)熱、肺胃熱盛所致的咽干、咽痛、喉核腫大、口渴、發(fā)熱;急慢性扁桃體炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染見上述證候者?，F(xiàn)收載于《中國藥典》2010 年版第一增補本［1］，含量測定項為HPLC 法測定金銀花提取物中綠原酸的量和黃芩提取物中黃芩苷的量。據(jù)文獻報道，綠原酸為多種植物共有成分，從菊花［2］、杜仲葉［3］、苧麻葉［4］，甚至葵花籽粕［5］和煙草廢棄物［6］中都可以提取并分離得到綠原酸，因此僅依據(jù)綠原酸的量難以監(jiān)督和控制金銀花提取物的投料。

咖啡?？鼘幩?caffeoyl quinic acids)類成分為金銀花中的一類非常重要的活性成分，在金銀花藥材及其制劑中發(fā)現(xiàn)的這類化合物主要有6 個:3-O-咖啡酰奎寧酸、綠原酸(5-O-咖啡酰奎寧酸)、4-O-咖啡酰奎寧酸、4，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，4-O-二咖啡?？鼘幩幔?］。馬雙成等［8］對金銀花藥材中的6 個咖啡酰奎寧酸進行了定量研究，本課題組曾對銀黃片［9］和銀黃含片［10］中上述成分的量進行測定。參考相關(guān)文獻［8-14］，本研究對銀黃顆粒中6 個咖啡?？鼘幩嵬瑫r定量測定，為銀黃顆粒中金銀花提取物的多成分質(zhì)量控制提供了數(shù)據(jù)支持。此外， 《中國藥典》2010 年版銀黃顆粒項下只收載了兩個規(guī)格，根據(jù)輔料、制成總量和每袋裝量的不同，本實驗收集到銀黃顆粒共有5 個規(guī)格，本研究也為不同規(guī)格銀黃顆粒中成分含有量限度的統(tǒng)一提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀(包括G1322A脫氣機，G1311A 四元泵，G1329A 自動進樣器，G1316A 柱溫箱，G1314B VWD 檢測器，ChemStation 工作站);Sartorius CP225D 電子天平(德國賽多利斯集團);綠原酸(5-O-咖啡?？鼘幩?，批號110753-201314，購自中國食品藥品檢定研究院;3-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡?？鼘幩?、4，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，4-O-二咖啡?？鼘幩?，批號分別為ps100603-07、ps100512-06、ps100623-01、ps100623-02、ps100623-03，均 購自成都普思生物科技有限公司，純度≥98%;甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純。銀黃顆粒收集自20家生產(chǎn)企業(yè)，共26 批。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取3-O-咖啡?？鼘幩?、5-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩?、4，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，5-O-二咖啡?？鼘幩帷?，4-O-二咖啡?？鼘幩釋φ掌愤m量，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.393 2、0.865 5、0.421 2、0.410 0、0.413 6、0.397 2 mg/mL 的對照品貯備液。分別精密量取上述對照品貯備液各3、5、3、3、3、5 mL，置同一100 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，上述6 種成分依次為11.80、43.28、12.64、12.30、12.41、19.86 μg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品適量，研細，取適量(相當(dāng)于綠原酸0.8 mg)，精密稱定，置50 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇40 mL，超聲(500 W，40 kHz)處理30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取除金銀花提取物以外的其他藥味，照處方的組成和比例制成不加金銀花提取物的陰性對照樣品，并按“2.1.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 Kromasil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);以乙腈為流動相A，以0.4% 磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫(0 ～15 min，5%A→20%A;15 ～30 min，20%A→30% A;30 ～45 min，30% A);體積流量1.0 mL/min;檢測波長327 nm;柱溫35 ℃;對照品進樣量10 μL，樣品為20 μL。在上述色譜條件下，6種成分的對稱因子均在0.95 ～1.05 范圍內(nèi)，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于8 000。樣品中其他成分對6 種待測成分的測定沒有干擾。色譜圖見圖1。

2.3 方法學(xué)

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液各1、3、6、9、12、16、18、20 μL，按“2.2”項下色譜條件進行測定，以進樣量X (μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果在相應(yīng)進樣量范圍內(nèi)，6 種成分線性關(guān)系良好，結(jié)果見表1。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次，結(jié)果3-O-咖啡?？鼘幩?、5-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡?？鼘幩帷?，5-O-二咖啡酰奎寧酸、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，4-O-二咖啡?？鼘幩岱迕娣e的RSD 分別為0.1%、0.1%、0.1%、0.2%、0.1%、0.1%。表明儀器的精密度良好。

圖1 混合對照品(A)、供試品(B)和陰性對照(C)HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，sample (B)，and negative sample (C)

表1 6 種成分線性關(guān)系測定結(jié)果Tab.1 Linearity of six components

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液于0、5、10、15、20、25 h 分別進樣20 μL，結(jié)果3-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩帷?，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，4-O-二咖啡酰奎寧酸峰面積的RSD 分別為0.6%、0.2%、0.2%、0.4%、0.1%、0.2%。表明供試品溶液中的6 個待測成分在室溫放置25 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批銀黃顆粒(批號120701)，按照“2.1.2”項下方法，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣20 μL 進行測定并計算，結(jié)果3-O-咖啡酰奎寧酸平均含有量為1.145 mg/g，RSD 為0.4%;5-O-咖啡?？鼘幩崞骄辛繛?.751 mg/g，RSD 為0.2%;4-O-咖啡?？鼘幩崞骄辛繛?.510 mg/g，RSD 為0.2%;4，5-O-二咖啡酰奎寧酸平均含有量為1.653 mg/g，RSD 為1.2%;3，5-O-二咖啡?？鼘幩崞骄辛繛?.109 mg/g，RSD 為0.7%;3，4-O-二咖啡?？鼘幩崞骄辛繛?.011 mg/g，RSD 為0.2%。結(jié)果表明其重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取“2.3.4”項下已測定的銀黃顆粒粉末0.1 g，精密稱定，共取6 份，置50 mL 量瓶中，精密加入“2.1.1”項下的混合對照品溶液10 mL (3-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡酰奎寧酸、4，5-O-二咖啡酰奎寧酸、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、3，4-O-二咖啡?？鼘幩豳|(zhì)量濃度分別為 11.80、43.28、12.64、12.30、12.41、19.86 μg/mL)，加50% 甲醇30 mL，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL 進行測定。結(jié)果3-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡酰奎寧酸、4，5-O-二咖啡?？鼘幩帷?，5-O-二咖啡酰奎寧酸、3，4-O-二咖啡?？鼘幩岬钠骄厥章?n =6)分別為96.2%、96.8%、 96.2%、 104.9%、 96.8%、 95.9%;RSD 分 別 為 0.6%、0.5%、1.3%、0.4%、0.2%、0.3%。

2.4 樣品測定 取不同廠家銀黃顆粒樣品共26 批，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣20 μL 進行測定，計算，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 分別以甲醇、50%甲醇和水為提取溶劑，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，結(jié)果50% 甲醇提取效率最高，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法和時間的選擇 以50%甲醇為溶劑，對超聲15、30、45 min 及加熱回流0.5、1 h進行考察。實驗結(jié)果表明，超聲30、45 min 及加熱回流0.5 h、1 h 效果相當(dāng)，而超聲比加熱回流操作簡便，故確定采用超聲30 min 進行提取。

表2 26 批銀黃顆粒中6 種咖啡?？鼘幩岬臏y定結(jié)果Tab.2 Determination of six caffeoyl quinic acids in 26 batches of Yinhuang Granules

3.3 取樣量的考察 分別取相當(dāng)于綠原酸0.4、0.8、1.6 mg 的樣品，精密稱定，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。前兩種取樣量的測定結(jié)果沒有顯著差異，而取樣量相當(dāng)于綠原酸1.6 mg時，測定結(jié)果稍低，此外考慮到取樣的均勻性，選擇相當(dāng)于綠原酸0.8 mg 的取樣量。

3.4 檢測波長的選擇 經(jīng)紫外光譜測定，6 個咖啡?？鼘幩犷惓煞衷?327 ±2)nm 處均有最大吸收峰［15］，故選擇以327 nm 作為檢測波長。

3.5 檢測結(jié)果的分析 根據(jù)輔料、制成總量和每袋裝量的不同，收集到的銀黃顆粒共有5 種規(guī)格:(1)每袋裝4 g、(2)每袋裝8 g、(3)每袋裝2 g(無蔗糖，制成總量300 g)、(4)每袋裝4 g (無蔗糖，制成總量300 g)和(5)每袋裝4 g (無蔗糖，制成總量600 g)?！吨袊幍洹?010 年版第一增補本僅收載了規(guī)格(1)和(3)，每袋含綠原酸量均規(guī)定為13.6 ～18.4 mg。

由于規(guī)格(1)、 (3)和(5)每次服用1 ～2袋，規(guī)格(2)和(4)每次服用0.5 ～1 袋，5 種規(guī)格的單次服用量按金銀花提取物折算相同。將不同規(guī)格的銀黃顆粒按單次服用量統(tǒng)一折算，26 批樣品的綠原酸和總咖啡酰奎寧酸的平均含有量分別為15.19、29.12 mg/袋。以《中國藥典》限度范圍的低限(13.6 mg)相對于綠原酸平均含有量(15.19 mg/袋)的百分比，折算總咖啡?？鼘幩岬暮辛康拖?，建議規(guī)定總咖啡?？鼘幩岵坏蒙儆?6.1 mg/袋。

由于《中國藥典》對綠原酸量進行了規(guī)定，26 批樣品的綠原酸含有量差別不大，但其他5 個咖啡酰奎寧酸含有量差異較大，不同生產(chǎn)企業(yè)之間差異尤為顯著，表明各企業(yè)使用的金銀花提取物質(zhì)量參差不齊，有必要對6 個咖啡酰奎寧酸同時進行測定，以規(guī)范和控制銀黃顆粒及其原料金銀花提取物的質(zhì)量。

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