李麗麗，馬雙雙，趙恒強(qiáng)，劉 偉，王 曉

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

咖啡?？鼘幩犷惢衔锸侵参镏谐Ｒ姷囊活愄烊环铀犷惢衔铮哂锌寡趸?、抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性，是天然藥物發(fā)揮藥效活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[1-2]?？Х弱？鼘幩崾怯煽鼘幩岷筒煌瑪?shù)目的咖啡?；ㄟ^(guò)酯化反應(yīng)縮合而成[3]。自然界中的咖啡?？鼘幩岚▎慰Х弱？鼘幩?、二咖啡酰奎寧酸、三咖啡?？鼘幩岷投嗫Х弱？鼘幩?，其中單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩嵩谥参镏袕V泛存在[4]。

圖1 單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬姆肿咏Y(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecule structures of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids R represents caffeoyl group(R代表咖啡?；?

咖啡?？鼘幩岬姆治龇椒òǜ咝б合嗌V法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[8-9]等。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法集成了液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度特點(diǎn)，在咖啡?？鼘幩岬姆蛛x分析中得到更為廣泛的應(yīng)用。由于咖啡?；涂鼘幩岬孽セ稽c(diǎn)不同，咖啡?？鼘幩犷惢衔锎嬖谠S多位置異構(gòu)體[10-11]。如金銀花中分離出單咖啡?？鼘幩犷惢衔铩?-O-咖啡酰奎寧酸、4-O-咖啡酰奎寧酸和5-O-咖啡?？鼘幩?，以及二咖啡酰奎寧酸類化合物——3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩醄12]。這些化合物在分子結(jié)構(gòu)上咖啡酰基數(shù)目不同或酯化位置不同(圖1)，而結(jié)構(gòu)上的差異則會(huì)引起藥效活性的顯著不同。研究發(fā)現(xiàn)二咖啡?？鼘幩犷惢衔锴宄鼶PPH自由基和超氧陰離子的能力高于單咖啡?？鼘幩犷惢衔?，具有更強(qiáng)的抗氧化活性[13]。4,5-二咖啡酰奎寧酸通過(guò)激活瞬時(shí)受體電位香草酸受體1(TRPV1)抑制炎癥反應(yīng)，而其它咖啡?？鼘幩峄衔镂窗l(fā)現(xiàn)這種作用機(jī)制[14]。因此，咖啡?？鼘幩嵛恢卯悩?gòu)體的準(zhǔn)確識(shí)別對(duì)植物功效物質(zhì)的開發(fā)具有重要意義。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，咖啡?？鼘幩岬奈恢卯悩?gòu)體在MS/MS分析下具有相同的碎片離子，給其定性帶來(lái)了困難。不同碰撞能誘導(dǎo)的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征可對(duì)不同位置異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分[15-16]。本研究對(duì)單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩嵛恢卯悩?gòu)體的色譜保留和不同碰撞能下的二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以實(shí)現(xiàn)LC-MS/MS分析下的快速鑒別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

乙腈、甲醇(色譜級(jí),德國(guó)默克公司)，甲酸(色譜級(jí),德國(guó)Honeywell Fluka)，3-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩?、5-O-咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩峒?,5-O-二咖啡?？鼘幩針?biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;超高效液相色譜儀(ACQUITY,H-Class,美國(guó)沃特世)，飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF-MS，Impact Ⅱ,德國(guó)布魯克);超純水由Millipore Direct-Q 8 UV-R超純水系統(tǒng)(美國(guó))制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

將標(biāo)準(zhǔn)品3-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡?？鼘幩?、5-O-咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡酰奎寧酸用甲醇-水(1∶1，體積比) 溶液溶解，配制成1 mg/mL的母液。

1.3 液相色譜條件

將3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡酰奎寧酸在不同洗脫梯度下進(jìn)行分析。色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm，美國(guó))，流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃。流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為純乙腈溶液，設(shè)置不同的洗脫梯度(見表1)。

表1 不同洗脫梯度下的流動(dòng)相組成Table 1 Composition of mobile phases with different elution gradients

1.4 MS/MS條件

在正離子模式下進(jìn)行采集。質(zhì)量數(shù)范圍為50～1 000，毛細(xì)管電壓3 500 V，霧化氣壓力30 kPa,干燥氣流速4 L/min，干燥氣溫度200 ℃，碰撞池碰撞能10 eV，傳輸時(shí)間80 μs，碰撞池射頻電壓振幅750 Vpp,脈沖前等待時(shí)間8 μs,二級(jí)碰撞能設(shè)置為15～80 eV。

1.5 金銀花中咖啡?？鼘幩岬姆治?/h3>

稱取金銀花100 mg，加入1 mL的甲醇-水(1∶1，體積比)溶液，渦旋5 min。離心10 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm),流速為0.4 mL/min,柱溫為40℃。流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為純乙腈溶液。洗脫梯度設(shè)置為：0～5 min，7% B；5～10 min，7%～10% B；10～13 min，10%～25% B；13～16 min，25%～33% B；16～17 min，33%～50% B；17～19 min，50% B；19～19.1 min，50%～5% B；19.1～23 min，5% B。質(zhì)譜條件設(shè)置如下：毛細(xì)管電壓3 500 V,霧化氣壓力200 kPa,干燥氣流速8 L/min,干燥氣溫度200 ℃,碰撞池碰撞能7 eV，傳輸時(shí)間60 μs，碰撞池射頻電壓振幅750 Vpp,脈沖前等待時(shí)間5 μs，二級(jí)碰撞能設(shè)置為15～45 eV。

1.6 數(shù)據(jù)處理

超高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)由Data Analysis 軟件(德國(guó)布魯克)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)不同碰撞能下的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，導(dǎo)出譜圖中的母離子、子離子以及強(qiáng)度信息。并提取出不同洗脫梯度下單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬谋Ａ魰r(shí)間數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬纳V保留分析

使用Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，在不同的洗脫梯度下，單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬谋Ａ魰r(shí)間見表2。單咖啡?？鼘幩嵩贑18柱上的保留較弱，洗脫時(shí)間在前。而二咖啡?？鼘幩嵩贑18柱上的保留較強(qiáng)，洗脫時(shí)間在后?？Х弱；脑黾訙p小了咖啡酰奎寧酸的極性，使得其在C18色譜柱的保留增強(qiáng)。洗脫梯度改變，咖啡?？鼘幩岜Ａ魰r(shí)間的絕對(duì)值發(fā)生變化，但其洗脫順序未發(fā)生改變。單咖啡酰奎寧酸在C18色譜柱的6個(gè)不同梯度下的洗脫順序均為5-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡酰奎寧酸，而二咖啡?？鼘幩岬南疵擁樞蚓鶠?,4-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩帷Ｔ撋V保留特征可為咖啡?？鼘幩嵛恢卯悩?gòu)體的鑒別提供參考。

表2 單咖啡酰奎寧酸和二咖啡?？鼘幩嵩诓煌疵撎荻认碌谋Ａ魰r(shí)間Table 2 Retention times of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids with different elution gradients t/min

2.2 單咖啡?？鼘幩岬亩?jí)質(zhì)譜分析

3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡酰奎寧酸是由一個(gè)咖啡酸和奎寧酸酯化而成。在低碰撞能下，其二級(jí)質(zhì)譜圖(以3-O-咖啡?？鼘幩釣槔?中主要信號(hào)離子包括母離子377和子離子215、163(圖2A、B)；在高碰撞能下，其主要信號(hào)離子包括子離子163、145、135、117(圖2C)。其中，信號(hào)離子163、145、135和117是咖啡?；奶卣髯与x子。隨著碰撞能的增加，母離子377的信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱，子離子163的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，成為基峰。在碰撞能25～35 eV時(shí)，母離子377和子離子163的強(qiáng)度變化最為顯著?？疾炝?種碰撞能(25、30、35 eV)下377/163強(qiáng)度比值的變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著碰撞能的增加，377/163的強(qiáng)度比值逐漸減小，此比值在單咖啡?？鼘幩嶂械拇笮№樞蛞来螢?-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩?圖2D)。單咖啡?？鼘幩岬慕Y(jié)構(gòu)區(qū)別是奎寧酸和咖啡酸的酯化位置不同，子離子163由酯鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生。分析結(jié)果說(shuō)明單咖啡酰奎寧酸中3-O-咖啡?？鼘幩嶙铍y發(fā)生裂解，5-O-咖啡?？鼘幩嶙钜装l(fā)生裂解，這與其幾何結(jié)構(gòu)、空間位阻和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)。

圖2 不同碰撞能下,3-O-咖啡酰奎寧酸的二級(jí)質(zhì)譜圖(A～C)和單咖啡?？鼘幩嶂?77/163的強(qiáng)度比值分布圖(D)Fig.2 MS/MS spectra of 3-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 377/163(D) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.3 二咖啡酰奎寧酸的二級(jí)質(zhì)譜分析

3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、3,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩崾怯?個(gè)咖啡酸和奎寧酸酯化而成。相對(duì)于單咖啡?？鼘幩?，在二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)，二咖啡?？鼘幩崾紫葋G失1個(gè)咖啡酰基，出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)為377的信號(hào)峰。二咖啡?？鼘幩嵩诘团鲎材芟?3,5-O-二咖啡?？鼘幩釣槔?，主要信號(hào)離子包括母離子539和子離子377(圖3A、B)，在高碰撞能下，其主要信號(hào)離子包括子離子377、215、163、145、135，子離子163成為基峰(圖3C)。隨著碰撞能的增加，母離子539的信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。子離子377的信號(hào)強(qiáng)度在25～35 eV范圍內(nèi)隨著碰撞能的增加而顯著增強(qiáng)，在35～45 eV范圍內(nèi)則隨著碰撞能的增加顯著減弱。子離子163在35～45 eV顯著增強(qiáng)。在25、30、35 eV碰撞能下，母離子539和子離子377的強(qiáng)度比值(539/377)順序?yàn)?,5-O-二咖啡酰奎寧酸>3,4-O-二咖啡?？鼘幩?3,5-O-二咖啡酰奎寧酸(圖3D)。在35、40、45 eV碰撞能時(shí)，子離子377和163的強(qiáng)度比值(377/163)順序?yàn)?,5-O-二咖啡?？鼘幩?4,5-O-二咖啡酰奎寧酸>3,4-O-二咖啡?？鼘幩?圖3E)。通過(guò)二咖啡?？鼘幩崮鸽x子539和子離子377的強(qiáng)度變化趨勢(shì)，結(jié)合單咖啡?？鼘幩岬牧呀庖?guī)律，推測(cè)3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岱謩e首先發(fā)生5-位、4-位和5-位的酯鍵斷裂得到子離子377。結(jié)果說(shuō)明由于二咖啡酰奎寧酸中咖啡?；〈恢貌煌斐闪似淇臻g位阻、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的差異，其中，4,5-O-二咖啡?？鼘幩嶙铍y發(fā)生裂解，3,5-O-二咖啡?？鼘幩嶙钜装l(fā)生裂解。

圖3 不同碰撞能下，3,5-O-二咖啡酰奎寧酸的二級(jí)質(zhì)譜圖(A～C),以及二咖啡?？鼘幩嶂?39/377(D)、377/163(E)的強(qiáng)度比值分布圖Fig.3 MS/MS spectra of 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 539/163(D) and 377/163(E) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.4 實(shí)際應(yīng)用

圖4 金銀花中咖啡?？鼘幩岬奶崛‰x子流色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of caffeoylquinic acids in honeysuckle1.5-O-caffeoylquinic acid,2.4-O-caffeoylquinic acid,3.3-O-caffeoylquinic acid,4.3,4-di-O-caffeoylquinic acid,5.3,5-di-O-caffeoylquinic acid,6.4,5-di-O-caffeoylquinic acid

單咖啡?？鼘幩岬亩?jí)質(zhì)譜裂解特征碎片離子為215、163、145、135、117。二咖啡?？鼘幩岬亩?jí)質(zhì)譜裂解特征碎片離子為377、215、163、145、135。在金銀花的LC-MS/MS分析中，通過(guò)精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)質(zhì)譜特征，基于4.4 min(峰1)，9.1 min(峰2)和9.4 min(峰3)識(shí)別出單咖啡?？鼘幩犷惓煞郑?5.4 min(峰4)、15.7 min(峰5)和16.0 min(峰6)識(shí)別出二咖啡酰奎寧酸類成分(圖4)。對(duì)于單咖啡?？鼘幩岢煞郑?77/163的強(qiáng)度比值在25 eV時(shí)依次為峰3(16.1)>峰2(3.4)>峰1(2.5)。對(duì)于二咖啡?？鼘幩岢煞郑?39/377的強(qiáng)度比值在25 eV時(shí)依次為峰6(4.4)>峰4(3.2)>峰5(1.9)，377/163的強(qiáng)度比值在35 eV時(shí)依次為峰5(3.0)>峰6(1.7)>峰4(1.5)。同時(shí)參考洗脫順序，金銀花中峰1、峰2和峰3分別鑒別為5-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡酰奎寧酸，峰4、峰5和峰6分別鑒別為3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩?，并通過(guò)標(biāo)樣驗(yàn)證。

3 結(jié) 論

單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩崾侵参锝缰谐Ｒ姷亩喾宇惢衔?，由于咖啡?；c奎寧酸的酯化位置不同，而存在很多位置異構(gòu)體。本研究對(duì)單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬奈恢卯悩?gòu)體進(jìn)行了色譜和二級(jí)質(zhì)譜分析?？Х弱；脑黾訙p小了咖啡?？鼘幩岬臉O性，使其在C18色譜柱的保留增強(qiáng)。單咖啡?？鼘幩岬奶卣魉槠x子有215、163、145、135、117，可通過(guò)母離子377和子離子163的強(qiáng)度比值(377/163)進(jìn)行區(qū)分。二咖啡酰奎寧酸的特征碎片離子有377、215、163、145、135，可通過(guò)母離子539、子離子377和163的強(qiáng)度比值(539/377、377/163)進(jìn)行區(qū)分?？Х弱？鼘幩犷惢衔锏纳V保留和質(zhì)譜裂解規(guī)律的揭示為其位置異構(gòu)體的快速鑒別提供了方法指導(dǎo)。