王繼龍， 陳方圓， 魏舒暢 ， 高建德， 范凌云， 余 琰

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000)

酶解法提取中藥材時(shí)，可在溫和條件下通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而減小成分?jǐn)U散時(shí)的傳質(zhì)阻力，不但有效成分提取率高，提取時(shí)間短，而且能保持天然產(chǎn)物的立體構(gòu)型和生物活性［1-3］。紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz 的干燥根［4］，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、消腫排膿、固表止汗等功效，由于該植物屬于纖維性根莖藥材，富含纖維素、半纖維素、果膠等易造成傳質(zhì)阻力的物質(zhì)，故適合復(fù)合酶酶解法提取，但目前相關(guān)的研究報(bào)道較少。由于二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)具有旋轉(zhuǎn)性，可克服均勻設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)、回歸正交設(shè)計(jì)等方法的不足［5-7］，因此本實(shí)驗(yàn)采用該方法對(duì)紅芪中芒柄花素和總皂苷的復(fù)合酶提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，期冀為紅芪等纖維性根莖類藥材中黃酮及皂苷類成分的提取制備提供參考。

1 儀器與材料

Waters 600E-2487 HPLC 色譜儀，包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters 公司);ABT100-5M 分析天平(德國(guó)Kern公司);UV Blue Star B 紫外-可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

芒柄花素對(duì)照品(純度≥98%，批號(hào)111703-200602，中國(guó)食品藥品檢定研究院);果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶(比活力分別為1.5 ×105、1.4×106、1.0×107u/g，甘肅華羚生物科技有限公司)。紅芪藥材購自甘肅省武都區(qū)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏舒暢教授鑒定為多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz 的干燥根。甲醇為色譜純(德國(guó)Merck 公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 芒柄花素的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.2%乙酸(60 ∶40);檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫31 ℃;進(jìn)樣量20 μL，結(jié)果見圖1。

圖1 對(duì)照品和供試品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.1.2 供試品溶液的制備 取紅芪藥材100 g，加入4 倍量水和適量酶后混勻，50 ℃下酶解一定時(shí)間后加熱滅活10 min，補(bǔ)水并回流提取3 次，過濾，濃縮(每1 mL 濃縮液相當(dāng)于0.25 g 原藥材)。然后，精密吸取濃縮液10 mL，乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ萦?0 mL 量瓶中，搖勻后過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芒柄花素對(duì)照品1.01 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度。然后，精密吸取溶液適量，加不同體積甲醇稀釋，即得一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系的考察 取“2.1.3”項(xiàng)下方法制得的對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果得到回歸方程y=1.27 ×105x+1.80×104，r=0.999 9，表明芒柄花素在0.020 2 ～0.323 2 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下方法制得的對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定RSD 值。結(jié)果，芒柄花素峰面積的RSD 為0.96%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下方法制得的供試品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、6、12、24、48 h 進(jìn)樣測(cè)定RSD 值。結(jié)果，芒柄花素峰面積的RSD 為1.62%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取紅芪濃縮液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定RSD 值。結(jié)果，芒柄花素峰面積的RSD 為1.32%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取紅芪濃縮液9份，每份5 mL，再分別精密加入芒柄花素對(duì)照品適量，加水至10 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備高、中、低3 個(gè)質(zhì)量濃度的加樣回收樣品溶液，每個(gè)濃度平行制備3 份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定RSD 值。結(jié)果，芒柄花素的平均回收率為99.45%，RSD 為1.52%，表明回收率良好。

2.2 總皂苷的測(cè)定 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下制得的濃縮液10 mL，水飽和正丁醇萃取4 次，每次分別為15、15、10、10 mL，合并萃取液，氨試液反萃2 次，每次5 mL，棄去氨水層，水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL 量瓶中。然后，采用差示比色法［8］，并按回歸方程ΔA=2.637 4 m-0.000 8 (r=0.999 3)計(jì)算總皂苷含有量。

2.3 復(fù)合酶比例的確定 根據(jù)文獻(xiàn)［9］研究報(bào)道，固定“2.1.2”項(xiàng)下部分酶解提取條件(酶解2 h，回流提取3 次，每次80 min，總水量24 倍)，應(yīng)用單因素試驗(yàn)分別考察果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的用量(0、50、100、200、400 mg)對(duì)芒柄花素和總皂苷提取量的影響。結(jié)果表明，兩者的提取量隨著酶用量增加，均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)果膠酶與木聚糖酶用量均為200 mg、纖維素酶為100 mg 時(shí)，提取量均達(dá)到最高，但隨著酶用量繼續(xù)增加，提取量均反而下降。因此，本實(shí)驗(yàn)確定復(fù)合酶的組成質(zhì)量比為果膠酶∶木聚糖酶∶纖維素酶=2 ∶2 ∶1。

2.4 二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)［10-15］

2.4.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 以復(fù)合酶用量(x1)、酶解時(shí)間(x2)、加水量(x3)和提取時(shí)間(x4)為試驗(yàn)因素，采用四元(1/2 實(shí)施)二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化紅芪中芒柄花素與總皂苷的酶解提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.1 Design and result of quadratic general rotary unitized tests

表2 y1 與y2 方差分析Tab.2 Variance analysis of y1 and y2

y2回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F1=4.912 2，F(xiàn)0.05(5，3) =9.01，F(xiàn)1＜F0.05，不顯著，表明本試驗(yàn)無其他因素的顯著影響;顯著性檢驗(yàn)F2=8.661 9，F(xiàn)0.01(11，8) =5.74，F(xiàn)2＞F0.01，極顯著，表明所建模型的預(yù)測(cè)值與測(cè)試值很吻合。另外在單因素中，僅x2不顯著，剔除α =0.10 的不顯著項(xiàng)后，得到簡(jiǎn)化后的回歸方程y2=1.657 4 +0.023 3x1+0.047 0x3+0.056 1x4。

2.4.2 單因素效應(yīng)分析 采用降維分析方法，對(duì)各因素進(jìn)行單因素效應(yīng)影響分析，結(jié)果見圖2。

圖2 各單因素與芒柄花素和總皂苷提取量的關(guān)系Fig.2 Relationships of each single factor and the extraction volumes of formononetin and total saponin

由圖2A 可以看出，y1隨著各因素取值增加，均呈先升高后降低的趨勢(shì)，其中x1對(duì)y1影響最大，其次是x3，而x4影響最小;由圖2B 可以看出，y2隨著各因素取值增加，均呈升高趨勢(shì)，其中x4對(duì)y2影響最大，其次是x3，而x2影響最小。

2.4.3 y1的交互作用效應(yīng)分析 由表2 可知，回歸方程中x1與x2和x1與x3的互作效應(yīng)對(duì)y1有顯著影響，因此需對(duì)這二組交互作用的因素作效應(yīng)分析。將兩個(gè)因素固定在零水平，通過作圖即可直觀地分析另兩個(gè)因素間的互作效應(yīng)，結(jié)果見圖3。由圖3A 可以看出，x2相同時(shí)，增加x1即可提高y1;但x2不同時(shí)，其變化趨勢(shì)也不同，其中x2較短時(shí)，盡管隨著x1增加也可提高y1，但程度不明顯，而延長(zhǎng)x2時(shí)，y1隨著x1變化有較為明顯的提高。以上結(jié)果表明，選擇適宜的x1和x2可使y1有較大提高;由圖3B 可以看出，x1相同時(shí)，y1隨著x3變化呈先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)x3一定時(shí)，x1對(duì)y1也有同樣作用趨勢(shì)。

圖3 x1 與x2 和x1 與x3 的交互作用效應(yīng)Fig.3 Interaction effect of x1 with x2 and x1 with x3

2.4.4 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證 由于試驗(yàn)中不僅存在單因素效應(yīng)，還有因素間的互作效應(yīng)，難以從單因素與互作效應(yīng)的分析中得到最佳工藝組合，同時(shí)四元二次回歸模型不存在提取量函數(shù)的極值。因此，本實(shí)驗(yàn)采用頻數(shù)分析法，分別分析各回歸模型以尋找最優(yōu)提取工藝，結(jié)果見表3，可知在95%置信區(qū)間內(nèi)，y1大于56.68 μg/g，y2大于1.62 mg/g。鑒于提取量和實(shí)際操作性，確定芒柄花素的最佳提取條件為復(fù)合酶用量340 mg，酶解時(shí)間110 min，加水量22 倍，提取時(shí)間150 min;總皂苷的最佳提取條件為復(fù)合酶用量280 mg，酶解時(shí)間90 min，加水量22 倍，提取時(shí)間190 min。

按照上述提取工藝方法，對(duì)優(yōu)化所得的工藝進(jìn)行驗(yàn)證，共5 批，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果，芒柄花素和總皂苷的平均提取量分別為69.99 μg/g 和1.68 mg/g，RSD 分別為1.20%和1.56%，與預(yù)測(cè)值(70.60 μg/g 和1.72 mg/g)接近，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性。

表3 芒柄花素與總皂苷各相關(guān)變量的頻率分布Tab.3 Probability distributions of each relative variable of formononetin and total saponin

3 討論

皂苷與黃酮是紅芪中的兩類主要活性成分，鑒于兩者在分子質(zhì)量大小及水中溶解度方面存在較大差異，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以總皂苷和芒柄花素為指標(biāo)，考察酶解提取工藝各因素對(duì)其提取量的影響，由此所得到的工藝條件對(duì)皂苷及黃酮類物質(zhì)的提取將有較高的參考價(jià)值。

課題組在前期研究［9］中，并未建立起總皂苷的酶解提取數(shù)學(xué)模型，推測(cè)可能是由于樣品中有能與香草醛-高氯酸顯色、不影響加樣回收率并通過差示法無法消除干擾的物質(zhì)存在。本實(shí)驗(yàn)在樣品處理時(shí)，加入氨試液進(jìn)行反萃，有利于進(jìn)一步消除干擾，并提高檢測(cè)方法的可靠性。應(yīng)用該方法時(shí)，總皂苷的測(cè)定結(jié)果雖有所下降，但在試驗(yàn)方案不變的情況下，建立起了總皂苷的酶解提取數(shù)學(xué)模型。

二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)因其精度一致和試驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，有利于獲得理想的提取工藝條件，但其能容納的因素?cái)?shù)有限。因此，本實(shí)驗(yàn)首先利用單因素試驗(yàn)，確定了果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的比例，同時(shí)通過前期研究，已確定了回流提取次數(shù)，而且由于各酶的最適pH 均與紅芪水提液的pH 接近，最適酶解溫度均為50 ℃，因此本實(shí)驗(yàn)不再對(duì)其進(jìn)行考察。由此可見，在該基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)，更為簡(jiǎn)便有效。

在單因素試驗(yàn)中，芒柄花素和總皂苷的提取量起初均隨著酶用量增加而升高，但當(dāng)提取量達(dá)到最大值時(shí)，隨著酶用量進(jìn)一步增加，提取量均反而降低，其機(jī)理有待作進(jìn)一步研究。

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