葛新　李林　王芳　郭廣成　李靖若　谷元廷

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科　河南 鄭州　450052)

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芒柄花素抑制乳腺癌細(xì)胞HIF-1α/CXCR4信號(hào)以及細(xì)胞增殖和遷移

葛新李林王芳郭廣成李靖若谷元廷

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科河南 鄭州450052)

目的研究芒柄花素對(duì)乳腺癌細(xì)胞行為的影響及其作用機(jī)制。方法利用不同濃度(5、10、15、20 μM)的芒柄花素處理MDA-MB-231細(xì)胞，分別處理48 h。應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和CXC趨化因子受體4(CXCR4)mRNA的表達(dá)，利用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)。構(gòu)建pShuttle-HIF-1α過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞。利用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，利用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞體外遷移。結(jié)果相比于對(duì)照組，芒柄花素顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，并且具有劑量依賴性。過(guò)表達(dá)HIF-1α提高芒柄花素處理后細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4的表達(dá)水平(P<0.05)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖(P<0.05)，并促進(jìn)癌細(xì)胞體外遷移(P<0.05)。結(jié)論芒柄花素可能通過(guò)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α/CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響癌細(xì)胞增殖和遷移。

芒柄花素；乳腺癌；低氧誘導(dǎo)因子-1α；CXC趨化因子受體4；增殖；遷移

芒柄花素是黃芪的有效成分之一，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素能夠通過(guò)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中Akt磷酸化抑制細(xì)胞增殖[2]。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、上皮間充質(zhì)化中具有重要作用[3-4]。目前，芒柄花素是否能夠通過(guò)調(diào)控HIF-1α和CXCR4影響乳腺癌細(xì)胞行為還不清楚。本研究通過(guò)探索芒柄花素在乳腺癌中的作用機(jī)制，從而為其在臨床治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；芒柄花素(C16H12O4，分子量268.264 08，純度≥98%)購(gòu)自上海純優(yōu)生物；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜、硝酸纖維素膜購(gòu)自大連寶生物公司；DNA Engine OpticonTM2熒光檢測(cè)系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；抗HIF-1α單抗、抗CXCR4單抗和酶標(biāo)羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理將MDA-MB-231細(xì)胞孵育于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、芒柄花素組、空載體組、HIF-1α過(guò)表達(dá)組。芒柄花素組分別用5、10、15、20 μM芒柄花素處理48 h?？蛰d體組和HIF-1α過(guò)表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pShuttle空載質(zhì)粒和pShuttle-HIF-1α質(zhì)粒24 h后，利用20 μM芒柄花素處理48 h。

1.2.2構(gòu)建pShuttle-HIF-1α表達(dá)載體將人HIF-1α cDNA克隆至pGEMTEasy載體，測(cè)序鑒定質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pGEM-HIF-1α及表達(dá)空載體pShuttle用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和ApaⅠ雙酶切，將HIF-1α片段與表達(dá)載體pShuttle連接，然后將重組表達(dá)載體pShuttle-HIF-1α轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，應(yīng)用Western分析方法檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)。

1.2.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔3×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)用于MTT實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后進(jìn)行。按實(shí)驗(yàn)分組情況，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)后培養(yǎng)4 h。去掉上清，按照每孔150 μl加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀(Bio-tek Instruments/USA)測(cè)定(測(cè)量波長(zhǎng)為570 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移用胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)3×105，轉(zhuǎn)移至Transwell 上層小室中，每孔鋪200 μl細(xì)胞，加入200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基。下層板孔中加入600 μl完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后取出小室用90%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取4個(gè)低倍視野(100×)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)利用Trizol試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞系總RNA，按照步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。查找Genbank序列設(shè)計(jì)并合成HIF-1α和CXCR4基因引物序列。HIF-1α上游引物：5’-CCT GAG CCT AAT AGT CCC-3’；下游引物：5’-GGT GGC ATT AGC AGT AGG-3’。CXCR4上游引物：5’-GGT GGT CTA TGT TGG CGT CT；下游引物： 5’-TGG AGT GTG ACA GCT TGG AG-3’。采用DNA Engine OpticonTM 2熒光檢測(cè)系統(tǒng)和DyNAmo SYBR Green qPCR 試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)的測(cè)定。取3次重復(fù)的平均值，靶基因的相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算由目的基因的拷貝數(shù)除以β-actin的拷貝數(shù)。

1.2.6Western blot檢測(cè)提取MDA-MB-231細(xì)胞中總蛋白，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用1%麗春紅染色檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果。將膜放在10 ml封閉液中(2%脫脂奶粉)1 h；加入抗HIF-1α單抗(1∶800)和抗CXCR4單抗(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育；加入酶標(biāo)羊抗鼠二抗抗體(1∶10 000)，室溫孵育2 h，利用化學(xué)發(fā)光法(ECL)，并在暗盒曝光。用凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析，比較蛋白條帶的相對(duì)積分吸光度(OD)值。

2　結(jié)果

2.1芒柄花素抑制HIF-1α mRNA和CXCR4 mRNA表達(dá)水平相比于對(duì)照組細(xì)胞，芒柄花素組MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α mRNA和CXCR4 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)。 當(dāng)芒柄花素劑量≥10 μM時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且劑量為20 μM時(shí)效果最為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1　芒柄花素處理后MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α和CXCR4 mRNA的表達(dá)

2.2芒柄花素抑制HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白表達(dá)水平芒柄花素劑量≥10 μM時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；當(dāng)藥物劑量為20 μM時(shí)，效果最明顯。見(jiàn)圖2和圖3。

圖2　芒柄花素處理后MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)

圖3　HIF-1α和CXCR4蛋白條帶定量分析

2.3過(guò)表達(dá)HIF-1α拮抗芒柄花素對(duì)CXCR4蛋白的影響與對(duì)照組比較，20 μM芒柄花素顯著抑制細(xì)胞中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)(P<0.05)。與空載體+芒柄花素組比較，HIF-1α過(guò)表達(dá)+芒柄花素組中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4和圖5。

圖4　過(guò)表達(dá)HIF-1α后MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α和CXCR4蛋白的表達(dá)

圖5　HIF-1α和CXCR4蛋白條帶定量分析

2.4過(guò)表達(dá)HIF-1α拮抗芒柄花素對(duì)細(xì)胞增殖的影響相比于對(duì)照組細(xì)胞，芒柄花素處理后的細(xì)胞增殖速率顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染pShuttle-HIF-1α后，MDA-MB-231細(xì)胞增殖速率明顯上升(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6　MTT法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞增殖

2.5過(guò)表達(dá)HIF-1α拮抗芒柄花素對(duì)細(xì)胞遷移的影響芒柄花素處理后的細(xì)胞遷移數(shù)目相比于對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)染pShuttle-HIF-1α后，細(xì)胞遷移數(shù)目顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖7和圖8。

圖7　Transwell法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞遷移

圖8　MDA-MB-231細(xì)胞遷移數(shù)目分析

3　討論

HIF-1α/CXCR4信號(hào)異?；罨蛔C明與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其中包括乳腺癌[5-6]。芒柄花素的抑癌作用也在多個(gè)研究中得到報(bào)道[7]。Wu等[8]發(fā)現(xiàn)芒柄花素可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、微血管形成，并在體內(nèi)抑制乳腺癌進(jìn)展相關(guān)的新血管形成。本研究利用不同劑量(5、10、15、20 μM)的芒柄花素體外處理乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，隨后檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)芒柄花素能夠顯著抑制HIF-1α和CXCR4的表達(dá)，并且具有劑量依賴性，說(shuō)明芒柄花素可能通過(guò)調(diào)控HIF-1α和CXCR4的表達(dá)影響乳腺癌疾病進(jìn)展。

本研究構(gòu)建了pShuttle-HIF-1α過(guò)表達(dá)載體，并在體外轉(zhuǎn)染pShuttle-HIF-1α及其空載體對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)HIF-1α可以顯著上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)水平。隨后，本研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素可抑制細(xì)胞增殖，而過(guò)表達(dá)HIF-1α則可以拮抗芒柄花素的作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)，本研究也檢測(cè)了芒柄花素對(duì)癌細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示芒柄花素可抑制癌細(xì)胞的體外遷移，而過(guò)表達(dá)HIF-1α則可以促進(jìn)細(xì)胞遷移，拮抗芒柄花素的作用。

綜上所述，芒柄花素能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α和CXCR4的表達(dá)，過(guò)表達(dá)HIF-1α可抵消芒柄花素對(duì)CXCR4的表達(dá)調(diào)控以及對(duì)癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。因此，HIF-1α可能是芒柄花素的重要調(diào)控靶基因，進(jìn)而影響癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

[1]Zhou R, Xu L, Ye M, et al. Formononetin inhibits migration and invasion of MDA-MB-231 and 4T1 breast cancer cells by suppressing MMP-2 and MMP-9 through PI3K/AKT signaling pathways[J]. Horm Metab Res, 2014, 46(11): 753-760.

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Formononetin regresses HIF-1α/CXCR4 signaling and cell proliferation and migration in breast cancer cells

Ge Xin, Li Lin, Wang Fang, Guo Guangcheng, Li Jingruo, Gu Yuanting

(DepartmentofBreastSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo investigate the effect of formononetin on breast cancer cell behavior as well as its mechanism. MethodsMDA-MB-231 cells were exposed to different doses (5, 10, 15, 20 μM) of formononetin for 48 h respectively. The expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) mRNA and CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) mRNA were analyzed by qRT-PCR. The expression of HIF-1α and CXCR4 protein were analyzed by Western blot method. Furthermore, pShuttle-HIF-1α overexpression vector was constructed and transfected into MDA-MB-231 cells. Cell proliferation was determined by MTT assay. Cell migration was evaluated by Transwell assay. ResultsCompared with the control, exposure of formononetin significantly decreased both mRNA and protein expression of HIF-1α and CXCR4 (P<0.05) in a dose dependent way. Overexpression of HIF-1α raised HIF-1α and CXCR4 expression in cancer cells after formononetin treatment (P<0.05), promoting cell proliferation (P<0.05) and enhancing cell migration (P<0.05). ConclusionFormononetin might affect breast cancer cell proliferation and migration through modulation of HIF-1α/CXCR4 signaling transduction.

formononetin; breast cancer; hypoxia-inducible factor-1α; CXC chemokine receptor 4; proliferation; migration

谷元廷，E-mail：zzyuantinggu@126.com。

R 737.9doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2016.09.003

2016-03-04)