廖燦城，許丹翹，劉曉紅，吳秀君 ，黃澤賢 ，易 軍，郭波紅*

（1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省婦幼保健院，廣東廣州510010）

芒柄花素平衡溶解度和油水分配系數(shù)的測(cè)定

廖燦城1，許丹翹1，劉曉紅1，吳秀君2，黃澤賢1，易 軍1，郭波紅1*

（1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省婦幼保健院，廣東廣州510010）

目的 測(cè)定芒柄花素的平衡溶解度和油水分配系數(shù)，為設(shè)計(jì)芒柄花素新劑型提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。方法 采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定芒柄花素在水、不同緩沖鹽溶液中的質(zhì)量濃度，并運(yùn)用搖瓶法測(cè)定芒柄花素在正辛醇-水、緩沖液體系中的表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果 37℃下芒柄花素在水中的平衡溶解度為2.079±0.036μg·mL-1，隨著pH值增大，芒柄花素的平衡溶解度增大。芒柄花素在正辛醇-水體系中的表觀油水分配系數(shù)lg Papp=2.79±0.03，隨著緩沖鹽溶液的pH值增大，芒柄花素在正辛醇-緩沖鹽溶液體系中的油水分配系數(shù)減小。結(jié)論建立的方法可以準(zhǔn)確測(cè)定芒柄花素的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)，科學(xué)合理地預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收與分布情況。

芒柄花素；平衡溶解度；高效液相色譜法；油水分配系數(shù)

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，芒柄花素（7—羥基—4′—甲氧基異黃酮）是一種異黃酮類化合物，主要存在于紅車軸草［1］、刺芒柄花［2］、黃芪［3］等植物中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。芒柄花素具有較好的抗腫瘤作用，已被應(yīng)用于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等治療，此外還有治療骨質(zhì)疏松、改善婦女更年期癥狀等用途，因而備受關(guān)注［4-9］。測(cè)定芒柄花素的平衡溶解度和油水分配系數(shù)對(duì)研究其體內(nèi)過(guò)程，可以比較科學(xué)合理地預(yù)測(cè)藥物的生物利用度，為新劑型的設(shè)計(jì)開發(fā)提供了處方前研究的基礎(chǔ)，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥也有著重要的意義。因此，本次試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定芒柄花素的質(zhì)量濃度，并運(yùn)用搖瓶法測(cè)定油水分配系數(shù)，為其設(shè)計(jì)劑型提供研究基礎(chǔ)。

圖1 芒柄花素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試劑

安捷倫1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Sartorius BS110S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；PKZ-1電熱恒溫振蕩水槽（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；芒柄花素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111703-201504）；芒柄花素原料藥（成都瑞芬思生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：C-018-150728）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（AR級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠）；甲醇（色譜純，北京迪馬公司）；水為超純水，其余試劑為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 芒柄花素分析方法的建立

2.1.1 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取適量芒柄花素對(duì)照品，加甲醇使之溶解，制成濃度為30μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。從對(duì)照品儲(chǔ)備液中精密移取2mL于10mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，得到濃度為6μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取適量芒柄花素原料藥，加甲醇使之溶解，制成濃度為30μg·mL-1芒柄花素供試品儲(chǔ)備液。從供試品儲(chǔ)備液中精密移取2mL于10mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，得到濃度為6μg·mL-1的供試品溶液。

不同pH磷酸鹽緩沖液的制備：按照2015版《中國(guó)藥典》第四部中通則的磷酸緩沖鹽溶液配制方法進(jìn)行制備。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取適量芒柄花素對(duì)照品加甲醇溶解，在波長(zhǎng)200～800 nm進(jìn)行掃描，芒柄花素在波長(zhǎng)249 nm處有最大吸收峰，磷酸緩沖鹽溶液在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收，不干擾芒柄花素的測(cè)定，因此選定249 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱為Dikma Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸的水溶液（體積比為70∶30），檢測(cè)波長(zhǎng) 249 nm，進(jìn)樣量 20 μL，流速 1mL·min-1，柱溫 30 ℃。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別從芒柄花素儲(chǔ)備液中依次精密移取0.25、0.5、1、2、4、8mL分別至于10mL容量瓶中，再用流動(dòng)相分別稀釋定容，搖勻得到0.75、1.5、3、6、12、24 μg·mL-1的系列濃度的芒柄花素對(duì)照品溶液，過(guò) 0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣測(cè)定含量。由芒柄花素峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=130.71 X+16.272，γ=0.999 7，表明 0.75～24 μg·mL-1線性關(guān)系良好

2.1.5 專屬性實(shí)驗(yàn)

取流動(dòng)相、供試品溶液、對(duì)照品溶液分別按設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣，記錄圖譜，結(jié)果見圖2，可見芒柄花素峰形良好，溶劑無(wú)干擾，專屬性良好。

圖2 芒柄花素高效液相色譜圖

2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取低、中、高濃度分別為1.5、6、24μg·mL-1的芒柄花素對(duì)照品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，得色譜圖峰面積積分并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.35%、0.28%、0.39%（n＝6）。24、48、72 h后平行操作，得到日間精密度的RSD分別為0.35%、0.12%、0.53%（n=3），表明儀器的精密度良好。

2.1.7 回收率實(shí)驗(yàn)

依次從供試品儲(chǔ)備液中精密量取0.25、1、4mL分別置于5mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度線，得到濃度為1.5、6、24μg·mL-1的低、中、高濃度的芒柄花素供試品溶液，每種濃度的芒柄花素供試品溶液制備3份，共9份。按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量，分別計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為101.72%±0.44%、98.60%±0.25%、99.20%±0.39%，表明該方法的回收率符合要求。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取芒柄花素供試品溶液，在 0、4、8、12、24、36、48、72 h，分別進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果 RSD 為0.57%。表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 檢測(cè)限與定量限

逐步稀釋對(duì)照品溶液，當(dāng)信噪比S/N=3∶1確定檢測(cè)限，信噪比S/N=10∶1確定定量限，結(jié)果芒柄花素的檢測(cè)限為 0.024 8 μg·mL-1，定量限為 0.0744 μg·mL-1。

2.2 芒柄花素的平衡溶解度測(cè)定［10］

取若干份過(guò)量芒柄花素置于100 mL具塞三角瓶中，分別加入水或 pH 值 2.0，5.0，5.8，6.8，7.4，8.0 磷酸鹽緩沖溶液，超聲至芒柄花素不再溶解，置于37℃水浴恒溫振蕩器，150 r·min-1振搖48 h，取適量經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，續(xù)濾液用流動(dòng)相稀釋至一定濃度后進(jìn)樣。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算芒柄花素在不同pH磷酸緩沖液中的溶解度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明芒柄花素在水或不同pH值磷酸鹽緩沖液中幾乎均不溶，在堿性環(huán)境中的溶解度略優(yōu)于酸性環(huán)境，提示芒柄花素在胃腸中溶解性很差。

表1 芒柄花素在水或不同pH值磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度

2.3 芒柄花素的油水分配系數(shù)測(cè)定

2.3.1 正辛醇飽和溶液的制備［11］

取一定體積正辛醇溶液加入等體積水中密封后置于磁力攪拌器上，37℃恒溫?cái)嚢?4 h，轉(zhuǎn)移至分液漏斗內(nèi)，靜置數(shù)小時(shí)后，分別取上層水飽和的正辛醇及下層正辛醇飽和的水備用。

2.3.2 表觀油水分配系數(shù)測(cè)定［12-13］

取適量芒柄花素加入一定體積水飽和正辛醇，超聲至充分溶解后，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，制備芒柄花素-正辛醇溶液，取適量進(jìn)樣，測(cè)定其在水飽和正辛醇中的濃度C1；取上述一定體積芒柄花素-正辛醇溶液置于具塞三角瓶中，再分別按1∶5的體積比例加入相應(yīng)體積正辛醇飽和的各pH磷酸鹽緩沖溶液，置于37℃水浴恒溫振蕩器中，150 r·min-1振蕩48 h，靜置分層，取下層水相適量，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣并計(jì)算濃度C2，按照下式計(jì)算芒柄花素的表觀油水分配系數(shù)Papp，結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芒柄花素在水中的表觀分配系數(shù)為616.6（lg Papp=2.79），在一定pH范圍內(nèi)，芒柄花素的表觀油水分配系數(shù)隨著pH的增大而減小，在pH8.0緩沖液中的表觀分配系數(shù)最小為257（lg Papp=2.41）。

3 討論

表2 芒柄花素在各pH值的正辛醇/磷酸緩沖液的表觀油水分配系數(shù)

目前測(cè)定藥物油水分配系數(shù)最常用的方法是搖瓶法，在理論上并沒(méi)有對(duì)正辛醇-水的比例進(jìn)行規(guī)定，只是從原則上進(jìn)行指導(dǎo)，水相的體積可以根據(jù)藥物在水中溶解度的大小而進(jìn)行相應(yīng)地調(diào)整。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，按照“2.3”項(xiàng)下的操作，發(fā)現(xiàn)正辛醇-水相的比例為1∶5時(shí)，水相中藥物濃度既可以滿足HPLC的測(cè)定，又符合藥物在油-水混合體系任一相中的濃度不超過(guò)0.01 mol·L-1的要求［14］，因此在選擇1∶5的比例測(cè)定芒柄花素的油水分配系數(shù)。另外取水樣時(shí)，為避免正辛醇的污染，可利用帶針頭的玻璃注射器來(lái)取水樣。首先在注射器內(nèi)吸入部分空氣。當(dāng)注射器通過(guò)正辛醇相時(shí)輕輕排出空氣，在水相中吸取足夠的水量后，迅速?gòu)娜芤褐谐槌鲎⑸淦鳎鹣箩橆^后，即可獲得無(wú)正辛醇污染的水相［13］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH值對(duì)芒柄花素油水分配系數(shù)有一定的影響，pH=2.0時(shí)，lg Papp=3.23±0.03；pH=8.0時(shí)，lg Papp=2.41 ± 0.01。據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，lg P＜-1或lg P＞5的化合物吸收都比較差；-1＜lg P＜5時(shí)，可以口服給藥且在腸道中較易被吸收；而當(dāng)藥物lg P＜0時(shí)，適合血管給藥。胃腸道不同部位的pH值分別為胃 1～3，十二指腸 4～6，空腸 6～7，回腸、結(jié)腸 7～8［15］。由此可見芒柄花素的水溶性稍提高，其將會(huì)在整個(gè)胃腸道都有較好的吸收，提示可利用環(huán)糊精等材料包合芒柄花素制備芒柄花素的口服制劑，以提高其生物利用度。

平衡溶解度與表觀分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)可以較為客觀合理地模擬藥物在生物體內(nèi)的水相和生物相之間的分配情況，對(duì)于預(yù)測(cè)藥物的滲透性及其生物利用度具有重要意義。芒柄花素在水中幾乎不溶，溶解度僅為2.08±0.15μg·mL-1，而其油水分配系數(shù)為616.6（lg Papp=2.79）。根據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（BCS）進(jìn)行分類［16］，芒柄花素屬于Ⅱ類低溶解性、高滲透性藥物，溶出速率將會(huì)成為吸收的限速過(guò)程，因此制備芒柄花素口服制劑的關(guān)鍵在于增加藥物在體內(nèi)的溶出度。目前有效改善BCSⅡ類藥物的溶出速率的常用方法有：微粉化、晶型修飾、環(huán)糊精包合、自乳化或制備成脂質(zhì)體、固體分散體、納米乳等劑型。

［1］馬強(qiáng),雷海民,周玉新,等.紅車軸草化學(xué)成分的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志,2005（14）:1057-1059.

［2］GAMPE N,DARCSIA,LOHNER S,et al.Characterization and identification of isoflavonoid glycosides in the root of Spiny restharrow（Ononisspinosa L.）by HPLC-QTOF-MS,HPLC-MS/MSand NMR［J］.JPharm Biomed Anal,2016,123:74-81.

［3］CHENG Y,XIA Z,HAN Y,etal.PlantNatural Product Formononetin Protects RatCardiomyocyte H9c2 Cell againstOxygen Glucose Deprivation and Reoxygenation via Inhibiting ROSFormation and Promoting GSK-3β Phosphorylation［J］.Oxid Med Cell Longev,2016,2016:1-11.

［4］盛佳鈺,陳紅風(fēng).芒柄花素聯(lián)合MK2206對(duì)不同亞型乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.中華腫瘤防治雜志,2015,22（13）:998-1003.

［5］胡昆,徐華金,辛文群,等.刺芒柄花素氮芥衍生物的合成及抗腫瘤活性［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43（2）:113-119.

［6］趙培,楊媛,徐揚(yáng),等.芒柄花素調(diào)節(jié)血脂代謝及改善動(dòng)脈粥樣硬化病變的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)新藥雜志,2009,18（10）:925-929.

［7］LIT Y,ZHAO X G,MO Z N,et al.Formononetin promotes cell cycle arrest via downregulation of Akt/Cyclin D1/CDK4 in human prostate cancer cells［J］.CellPhysiolBiochem,2014,34（4）:1351-1358.

［8］YANGQ,CHENG,YANGY,etal.Formononetin amelioratesDSS-induced ulcerative colitis inmice through induction ofNrf2 in colons［J］.JournalofChinese PharmaceuticalSciences,2016,25（3）:178-188.

［9］ZHOU R,XU L,YEM,etal.Formononetin inhibitsmigration and invasion ofMDA-MB-231 and 4T1 breast cancer cells by suppressingMMP-2 and MMP-9 through PI3K/AKT signaling pathways［J］.Horm Metab Res,2014,46（11）:753-760.

［10］滕希峰,王峰,李榮坤,等.反向高效液相色譜法測(cè)定水楊酸的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2017,36（2）:186-189.

［11］馮倩茹,葉柳青,劉園園,等.光甘草定平衡溶解度和油水分配系數(shù)的測(cè)定［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（1）:54-56.

［12］郭波紅,程怡,林綠萍,等.甘草次酸平衡溶解度和油水分配系數(shù)的測(cè)定［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2011,27（3）:221-223.

［13］蘇德森,王思玲.物理藥劑學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:102-103.

［14］全國(guó)信息與文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).化學(xué)品分配系數(shù)（正辛醇-水）搖瓶法試驗(yàn):GB/T21853-2008［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

［15］楊秀麗,孫進(jìn),何仲貴.格列吡嗪油水分配系數(shù)和平衡溶解度放入測(cè)定［J］.中國(guó)藥劑學(xué)雜志,2009,7（3）:121-126.

［16］葉雯,王永祿,李學(xué)明.生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)在難溶性藥物處方設(shè)計(jì)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33（7）:568-570.

Determination of equilibrium solubility and oil/water partition coefficient of formononetin

LIAO Can-cheng1,XU Dan-qiao1,LIU Xiao-hong1,WU Xiu-jun2,HUANG Zexian1,YIJun1,GUOBohong1
（1.School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2.Guangdong Women and Children Hospitaland Health Institute,Guangzhou 510010,China）

Objective To determine the equilibrium solubility and the apparent oil/water partition coefficient of formononetin for designing new formulations.Methods The mass concentration of formononetin in water or phosphatebuffer with differentpH wasdetected by HPLC,and theshake flaskmethod wasused to determine the apparent partition coefficient of formononetin in n-octanol-water-buffer solutions of different pH.Result The equilibrium solubility of formononetin was 2.079±0.036μg·mL-1 in water at 37℃ and increased with the pH of buffer solution increasing.lg Pappof formononetin was 2.79±0.03 in n-octanol-water system and decreased with the pH of buffer solution increasing.Conclusion Themethods founded in this research can be used to determine accurately the equilibrium solubility and apparent partition coefficient of formononetin,and predict the in vivo absorption and distribution of formononetin.

formononetin;equilibrium solubility;HPLC;partition coefficient

R927

A

1008-0171（2017）06-0071-05

2017-10-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81403111）

廖燦城（1993-），男，廣東博羅人，廣東藥科大學(xué)藥劑學(xué)研究生。

*通信作者：郭波紅（1976-），女，湖南長(zhǎng)沙人，廣東藥科大學(xué)副教授。

鄧軍文 dengjunwen69@126.com】