李光+龔寧

摘要：對(duì)生長一致的金線蘭組培苗進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)，采用分光光度法和同工酶電泳技術(shù)分別研究了干旱脅迫期間金線蘭POD活性及同工酶酶譜的變化。結(jié)果表明：干旱脅迫下，金線蘭POD活性呈現(xiàn)“M”形的變化規(guī)律，同工酶條帶數(shù)量發(fā)生改變，在脅迫的前2d，在“-”區(qū)產(chǎn)生4條新的酶帶，表明在干旱脅迫下，金線蘭試管苗迅速誘導(dǎo)POD新酶帶以適應(yīng)脅迫環(huán)境。脅迫3d，酶帶條數(shù)減少到5條，與此同時(shí)POD活性也降到最低。從脅迫后4d起，在“+”區(qū)產(chǎn)生2條新的酶帶。這可能是POD同工酶的表達(dá)基因有部分關(guān)閉或開啟，導(dǎo)致酶帶條數(shù)的增減。

關(guān)鍵詞：干旱脅迫；金線蘭；同工酶酶譜

中圖分類號(hào)：Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0208-02

干旱脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其他細(xì)胞組分嚴(yán)重?fù)p傷[1-3]。在植物的抗氧化酶系統(tǒng)中，POD能將H2O2分解為無害的H2O和O2，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度，對(duì)維持植物正常的生理功能具有重要意義[4-6]。金線蘭[Anoectochilusroxburghii（Wall.）Lindl]，別名花葉開唇蘭，為蘭科開唇蘭屬植物[7]，生活在陰濕環(huán)境中，干旱脅迫對(duì)金線蘭的傷害較其他逆境嚴(yán)重。目前，金線蘭組培快繁已經(jīng)取得成功，已經(jīng)進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，但是有關(guān)金線蘭組培苗抗旱的研究鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)對(duì)干旱脅迫下金線蘭的POD活性和同工酶變化進(jìn)行研究，為進(jìn)一步了解干旱脅迫條件下金線蘭的生理響應(yīng)機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1材料

材料為生長一致的金線蘭組培苗，由貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院培養(yǎng)室提供。

1.2方法

取出金線蘭組培苗，無菌水將幼根沖洗干凈，放入MS營養(yǎng)液中適應(yīng)性培養(yǎng)3d，再移入含不同濃度PEG6000的溶液中進(jìn)行根際干旱脅迫處理。PEG6000的干旱脅迫設(shè)4個(gè)濃度處理：10%（處理Ⅰ）、20%（處理Ⅱ）、30%（處理Ⅲ）、40%（處理Ⅳ），每種處理重復(fù)3次。同工酶分析選擇20%PEG6000處理的金線蘭組培苗，培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，每天光照12h（08：00—20：00），光照強(qiáng)度為3000lx。

1.2.1粗酶液的制備準(zhǔn)確稱取成熟鮮葉0.50g，加入預(yù)冷的酶提取液（50mmol/LpH值7.8磷酸緩沖液內(nèi)含0.1mmol/LEDTA，0.3%TritonX-100，4%PVP）5mL，冰浴充分研磨，于冷凍離心機(jī)（4℃）12000r/min離心20min，上清液即為粗酶液，冷藏備用。

1.2.2過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[8]，3.0mL反應(yīng)混合液（50.0mmol/L磷酸緩沖液500mL中含0.28mL愈創(chuàng)木酚和30%的H2O20.19mL）中加入50.0μL酶液，迅速搖勻，測D470nm。每30s讀數(shù)1次，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，單位為U/（min·g）。

1.2.3電泳

1.2.3.1加樣

濃縮膠聚合之后，小心拔出梳子，用濾紙條吸干梳孔中的水分，并注入預(yù)冷已稀釋10倍的電極緩沖液。從冰箱冷凍室中取出樣品，4℃下解凍，待樣品解凍后，用微量進(jìn)樣器吸取80.0μL酶液，小心注入梳孔底部，同時(shí)記錄樣品號(hào)和相應(yīng)的樣品槽號(hào)，加入1滴0.1%的溴酚藍(lán)指示劑。將電泳槽小心移入4℃冰箱中電泳。電泳條件：120min前電泳電壓100B，120min后電泳電壓200B，電泳時(shí)間22h。

1.2.3.2過氧化物同工酶染色

膠電泳完畢并經(jīng)雙蒸水沖洗3次后，在染液（0.1g聯(lián)苯胺，5.0mL無水乙醇，10.0mL1.5mol/L乙酸鈉，10.0mL1.5mol/L乙酸）中加入6～10滴30%的H2O2，迅速搖勻后倒在凝膠上，并將染色盒置于水平搖床上，室溫下輕微搖動(dòng)。待橙黃色酶帶完全出現(xiàn)（約15min）后，倒出染色液，自來水沖洗，數(shù)碼相機(jī)拍照后放入7%乙酸中保存。

2結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對(duì)金線蘭組培苗葉片過氧化物酶（POD）的影響

由圖1可知，干旱脅迫下不同處理葉片POD活性總體上呈現(xiàn)“M”形的變化規(guī)律，處理1在處理后2d，達(dá)到第1個(gè)峰值，達(dá)152.94U/（min·g），脅迫3～4d逐步降低，脅迫5～6d再次升高，到脅迫6d達(dá)第2個(gè)峰值。處理2、處理3、處理4的第1個(gè)峰值在脅迫3d出現(xiàn)。脅迫3～5d逐步降低，脅迫5d達(dá)最低，脅迫6d又迅速升高，達(dá)第2個(gè)峰值，脅迫7d再次下降。各處理第1次的峰值大于第2次的峰值，第1次峰值的大小順序依次為：處理2[298.098U/（min·g）]>處理4[232.888U/（min·g）]>處理3[195.584U/（min·g）]>處理1[152.941U/（min·g）]。可見，金線蘭對(duì)不同濃度的PEG6000干旱脅迫處理影響存在很大差異，其中20%的PEG6000處理，POD活性上升最高，因而選取這一濃度處理用于后續(xù)同工酶分析。

2.2組培苗過氧化物同工酶分析

組培苗POD同工酶電泳結(jié)果見圖2。從圖2可見過氧化物同工酶譜帶共11條。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，酶帶表現(xiàn)一定的變化。脅迫1～2d，在“-”區(qū)產(chǎn)生4條新的酶帶，表明在干旱脅迫下，金線蘭試管苗迅速誘導(dǎo)POD新酶帶產(chǎn)生以適應(yīng)脅迫環(huán)境。脅迫3d，酶帶條數(shù)減少到5條，與此同時(shí)POD活性也降到最低。脅迫4d起，在“+”區(qū)產(chǎn)生2條新的酶帶，表明在干旱脅迫過程中，金線蘭可能通過2種響應(yīng)途徑產(chǎn)生POD同工酶。

3結(jié)論

水分是植物的重要組成部分，是植物賴以生存的必要條件之一，無論是長期干旱還是短時(shí)間的水分虧缺都可能對(duì)植物的生長發(fā)育產(chǎn)生不同程度的影響。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物抗旱機(jī)理作了大量研究，取得了較好的研究成果，但是金線蘭分布范圍較窄，長期以來人們多關(guān)注于金線蘭的藥效研究，對(duì)于其抗旱性研究較少。周黎等以3種不同來源的金線蘭組培苗（種子苗、根狀莖苗、地上莖苗）為試驗(yàn)材料，研究金線蘭組培苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在土壤干旱脅迫下的變化規(guī)律[9]，但是他們僅僅研究了可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游離脯氨酸受干旱脅迫后的變化情況，未提及POD在干逆脅迫條件下的變化情況。POD是重要的抗旱相關(guān)酶，對(duì)金線蘭干旱脅迫下POD活性及同工酶帶的變化進(jìn)行研究具有重要的意義。

本研究結(jié)果表明，在持續(xù)干旱脅迫下，金線蘭POD同工酶的電泳條帶發(fā)生變化，即在干旱脅迫處理1～2d，金線蘭POD同工酶的酶帶數(shù)量逐漸增加，脅迫2d酶帶數(shù)量達(dá)到最大。脅迫3d酶帶數(shù)量急劇減少到最少，脅迫4～6d的酶帶數(shù)量有所回升，這個(gè)變化與金線蘭POD活性的變化基本一致?？赡艿脑蚴牵诟珊得{迫的過程中，由于金線蘭POD同工酶的部分酶帶前體的活化，產(chǎn)生了新的酶帶，這可能是在干旱脅迫下，金線蘭POD酶帶在脅迫1～2d有所增加的原因。隨著脅迫時(shí)間的延長，酶發(fā)生了降解或部分降解，導(dǎo)致部分酶帶消失或變淺，這可能就是干旱脅迫4dPOD同工酶酶帶減少至最少的原因。而后3dPOD酶帶有所增加，這可能是金線蘭在受到較長時(shí)間的干旱脅迫后啟動(dòng)了新的POD的機(jī)制。由于POD較易失活，金線蘭POD同工酶酶帶的變化也可能完全是由相關(guān)基因的關(guān)閉和開啟造成的，即在干旱脅迫的初期，金線蘭迅速打開應(yīng)急機(jī)制增加POD含量，隨著脅迫的持續(xù)，金線蘭增加POD含量的應(yīng)急機(jī)制逐漸失效，導(dǎo)致脅迫3dPOD酶帶減少至最少，脅迫5～7d金線蘭POD酶帶的增加，可能是由于金線蘭啟動(dòng)了抵抗干旱脅迫的長效機(jī)制。然而金線蘭在干旱脅迫條件下POD活性及酶帶的變化究竟是由哪種機(jī)制調(diào)控的，需要進(jìn)一步分子生物學(xué)的研究，以深入了解干旱脅迫下金線蘭POD相關(guān)基因表達(dá)的變化情況。

參考文獻(xiàn)：

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本研究結(jié)果表明，在持續(xù)干旱脅迫下，金線蘭POD同工酶的電泳條帶發(fā)生變化，即在干旱脅迫處理1～2d，金線蘭POD同工酶的酶帶數(shù)量逐漸增加，脅迫2d酶帶數(shù)量達(dá)到最大。脅迫3d酶帶數(shù)量急劇減少到最少，脅迫4～6d的酶帶數(shù)量有所回升，這個(gè)變化與金線蘭POD活性的變化基本一致?？赡艿脑蚴?，在干旱脅迫的過程中，由于金線蘭POD同工酶的部分酶帶前體的活化，產(chǎn)生了新的酶帶，這可能是在干旱脅迫下，金線蘭POD酶帶在脅迫1～2d有所增加的原因。隨著脅迫時(shí)間的延長，酶發(fā)生了降解或部分降解，導(dǎo)致部分酶帶消失或變淺，這可能就是干旱脅迫4dPOD同工酶酶帶減少至最少的原因。而后3dPOD酶帶有所增加，這可能是金線蘭在受到較長時(shí)間的干旱脅迫后啟動(dòng)了新的POD的機(jī)制。由于POD較易失活，金線蘭POD同工酶酶帶的變化也可能完全是由相關(guān)基因的關(guān)閉和開啟造成的，即在干旱脅迫的初期，金線蘭迅速打開應(yīng)急機(jī)制增加POD含量，隨著脅迫的持續(xù)，金線蘭增加POD含量的應(yīng)急機(jī)制逐漸失效，導(dǎo)致脅迫3dPOD酶帶減少至最少，脅迫5～7d金線蘭POD酶帶的增加，可能是由于金線蘭啟動(dòng)了抵抗干旱脅迫的長效機(jī)制。然而金線蘭在干旱脅迫條件下POD活性及酶帶的變化究竟是由哪種機(jī)制調(diào)控的，需要進(jìn)一步分子生物學(xué)的研究，以深入了解干旱脅迫下金線蘭POD相關(guān)基因表達(dá)的變化情況。

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本研究結(jié)果表明，在持續(xù)干旱脅迫下，金線蘭POD同工酶的電泳條帶發(fā)生變化，即在干旱脅迫處理1～2d，金線蘭POD同工酶的酶帶數(shù)量逐漸增加，脅迫2d酶帶數(shù)量達(dá)到最大。脅迫3d酶帶數(shù)量急劇減少到最少，脅迫4～6d的酶帶數(shù)量有所回升，這個(gè)變化與金線蘭POD活性的變化基本一致?？赡艿脑蚴牵诟珊得{迫的過程中，由于金線蘭POD同工酶的部分酶帶前體的活化，產(chǎn)生了新的酶帶，這可能是在干旱脅迫下，金線蘭POD酶帶在脅迫1～2d有所增加的原因。隨著脅迫時(shí)間的延長，酶發(fā)生了降解或部分降解，導(dǎo)致部分酶帶消失或變淺，這可能就是干旱脅迫4dPOD同工酶酶帶減少至最少的原因。而后3dPOD酶帶有所增加，這可能是金線蘭在受到較長時(shí)間的干旱脅迫后啟動(dòng)了新的POD的機(jī)制。由于POD較易失活，金線蘭POD同工酶酶帶的變化也可能完全是由相關(guān)基因的關(guān)閉和開啟造成的，即在干旱脅迫的初期，金線蘭迅速打開應(yīng)急機(jī)制增加POD含量，隨著脅迫的持續(xù)，金線蘭增加POD含量的應(yīng)急機(jī)制逐漸失效，導(dǎo)致脅迫3dPOD酶帶減少至最少，脅迫5～7d金線蘭POD酶帶的增加，可能是由于金線蘭啟動(dòng)了抵抗干旱脅迫的長效機(jī)制。然而金線蘭在干旱脅迫條件下POD活性及酶帶的變化究竟是由哪種機(jī)制調(diào)控的，需要進(jìn)一步分子生物學(xué)的研究，以深入了解干旱脅迫下金線蘭POD相關(guān)基因表達(dá)的變化情況。

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