曾瑾+馬臣杰+鄧光存+劉曉明

摘要：梭菌毒素作為產氣莢膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多種疾病，其中β1毒素和β2毒素是由C型菌產生的2種引起動物壞死性腸炎的主要致病因子?；蚬こ讨亟M毒素蛋白已作為潛在候選疫苗用于預防該菌所引起的多種傳染性疾病，大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）是一種常用的黏膜免疫佐劑。本研究將ltb-cpb2-cpb1及l(fā)tb-cpa融合基因進行IPTG的誘導表達，制備了包涵體粗提物，并對小白鼠進行免疫攻毒試驗及其免疫后抗原免疫保護期的免疫原性的研究。結果顯示，經LTB-CPB2B1及LTB-CPA重組蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天時用產氣莢膜梭菌強毒攻擊，可獲得很好的保護，產氣莢膜梭菌毒素與LTB融合基因重組菌株能夠有效刺激免疫小白鼠產生特異性抗體。說明該重組菌株可以作為預防產氣莢膜梭菌所引起疾病的候選菌株。

關鍵詞：產氣莢膜梭菌；毒素；大腸桿菌不耐熱腸毒素；亞單位；免疫原性；疫苗保護周期

中圖分類號：R392；Q939.9文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0216-03

產氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringns）屬腐生性厭氧芽孢致病菌，在土壤中廣泛存在，具有廣泛的疫源地，是引起動物出血性壞死性腸炎、腸毒血癥以及人類食物中毒、創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一，主要引起動物猝死癥和腸毒血癥[1]。該菌分為A、B、C、D、E等5型，其致病因子主要是菌體產生的外毒素，各種毒素引起的動物猝死癥和幼畜出血性壞死性腸炎（羔羊痢疾、犢牛腸毒血癥等）是一類世界性的人獸共患傳染病，在我國廣大牧區(qū)的流行十分嚴重，有較高的發(fā)病率（30%～80%）和死亡率（10%～30%），即使是病愈存活的幼畜，其生長發(fā)育和生產性能也會受到嚴重的影響，給畜牧業(yè)造成巨大的經濟損失，對我國畜牧業(yè)生產構成嚴重威脅[2]。該菌的免疫預防是控制這類疾病的最佳選擇。安全高效預防產氣莢膜梭菌的基因工程疫苗市場前景廣闊。

β1毒素是多種產氣莢膜梭菌的一種重要的致死性毒素，能引起仔豬出血性壞死性腸炎。Hunter等首先克隆了β1毒素基因，其大小為1.0kb，分子量為34ku，但它在種族菌株中常以多聚體形式存在[3]。許崇波等將從C型產氣莢膜梭菌中克隆的β毒素基因與大腸桿菌耐熱腸毒素基因（ST）融合，成功表達出了相應的融合蛋白，該表達產物免疫小白鼠后，可誘發(fā)機體產生中和抗體[2]。1997年法國巴斯德研究所的Gibert等首次報道，從1株分離自仔豬壞死性腸炎病例的C型產氣莢膜梭菌（CWC245）的培養(yǎng)上清中純化到一種β2毒素，結果表明，β2毒素的基因序列與β1毒素及其他已知的產氣莢膜梭菌毒素的序列沒有明顯的同源性，但具有同樣的生物學活性，它們都可導致腸壁的出血和壞死，對小白鼠均有致死活性；而且β2毒素和β1毒素的免疫學相關性較差[4]。王玉炯等已克隆了β1毒素基因和β2毒素基因，并測定了其核苷酸序列[5]，Zeng等將從C型產氣莢膜梭菌中克隆的α、β1、β2毒素基因融合，成功表達出了相應的融合蛋白，該表達產物免疫小白鼠、牛及豬后，可誘發(fā)機體產生中和抗體[6]。

大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素（Escherichiacoliheat-labileenterotoxin，LT）是由大腸桿菌產毒株合成的一種毒素，是繼霍亂弧菌腸毒素CTB后發(fā)現的一種新公認的強效黏膜免疫原和黏膜免疫佐劑，該毒素及其亞單位在過去20年中研究范圍較廣[7]。LT的作用與其A、B亞單位緊密聯系。LTA特有ADP核糖基化活性，可致腸上皮細胞持續(xù)合成cAMP和大量電解質及腸液的分泌，引起腹瀉；LTB與表達于細胞表面的GM1神經節(jié)苷脂及其受體有極高親和力，在LT的免疫原性和佐劑作用中扮演極重要的角色[8]。將其與目的抗原混合或與目的抗原偶聯起來免疫動物，可促進黏膜細胞對目的抗原的攝取，激發(fā)機體的免疫應答。LTB還具有消除機體對免疫抗原的耐受，誘發(fā)機體對免疫抗原的長期記憶[9]，所以LTB不但對有大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素所引起的腹瀉具有一定預防作用，也可作為免疫佐劑加強其他抗原的免疫應答。為了充分發(fā)揮LTB的免疫佐劑作用和免疫原性，利用基因工程可構建抗原融合蛋白、純化重組LTB與其他抗原協同誘發(fā)免疫機體的免疫應答反應。在人口腔常駐菌戈登變形鏈球菌表面表達的LTB-M6融合蛋白，刺激BalB/C小白鼠高水平的局部和系統免疫反應。Rask等以人丙種球蛋白模擬蛋白抗原與LTB混合或化學偶聯，再與無毒LT聯合時誘導的免疫反應也大大增強[9]。將LTB的編碼基因導入載體pNU212后，在短桿菌中高水平表達，這種重組LTB的氨基酸序列、分子量、GM1黏結能力與天然LTB幾乎相同，有良好應用前景[10]。

筆者所在實驗室已利用基因工程技術構建了β2-β1毒素融合基因并在大腸桿菌中得到了表達，同時還進行了免疫原性研究[11]。在研究中發(fā)現，該基因工程滅活疫苗還存在免疫原性不穩(wěn)定、免疫效果與生產工藝密切相關等問題。LTB是一種常用的黏膜免疫佐劑，由于LTB與靶細胞神經節(jié)苷脂結合的功能，常作為抗原載體，與抗原聯合時以佐劑作用加強免疫細胞對抗原的攝取[10]。本研究構建了ltb-cpb2-cpb1融合基因，在大腸桿菌中實現了表達，并以融合蛋白作為免疫原進行小白鼠免疫攻毒試驗，獲得了理想的保護效果。該研究為生產工藝簡化的產氣莢膜梭菌疫苗提供良好的候選菌株，最終解決了仔豬紅痢和反芻動物壞死性腸炎或腸毒血癥免疫預防這一難題。

1材料與方法

1.1菌株

受體菌BL21（DE3）（LTB-CPA）（含ltb-cpa融合基因）、BL21（DE3）（LTB-CPB2B1）（含ltb-cpb2-cpb1融合基因）由西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室構建并保存；C型產氣莢膜梭菌強毒株C59-44購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2試驗動物endprint

18～20gICR小白鼠購自寧夏醫(yī)學院實驗動物中心。

1.3試驗方法

1.3.1免疫用抗原的制備

1.3.1.1LTB-CPA及LTB-CPB2-CPB1融合蛋白的表達及包涵體的純化

取BL21（DE3）（含LTB-CPA質粒）、BL21（DE3）（含LTB-CPB2B1質粒）凍存菌種各1支，在含30μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線，挑取LB平板的單個菌落，接種于25mL含30μg/mL卡那霉素的LB試管中，于37℃下振蕩至D600nm值達1.0為止，加IPTG誘導4h，取25mL以超聲破碎儀超聲處理5個10s后，洗滌沉淀，獲得融合蛋白的包涵體；將制備的LTB-CPA及LTB-CPB2-CPB1包涵體粗提物以BCA蛋白定量法定量后用滅菌生理鹽水稀釋，按質量比1∶1均勻混合，至終濃度為2mg/mL，作為免疫用抗原[12]。

1.3.1.2CPA及CPB2-CPB1包涵體的制備及化學佐劑的添加

取BL21（pCPA）、BL21（pCPB2B1）凍存菌種各1支，在含30μg/mL卡那霉素的LB平板上劃線，制備包涵體，BCA法定量。將制備好的CPA及CPB2-CPB1包涵體粗提物用滅菌生理鹽水稀釋，按質量比1∶1均勻混合，至終濃度為2mg/mL，加入氫氧化鋁凝膠至終濃度為10%，作為對照組小白鼠免疫用抗原[12]。

1.3.2C型產氣莢膜梭菌毒素粗提物的制備及ICR小白鼠LD100測定

將C型產氣莢膜梭菌強毒株（C59-44）接種于肝片肉湯厭氧培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；4℃5000r/min離心20min，以0.44μm微孔濾膜過濾除菌制成毒素粗提物；將毒素粗提物用滅菌生理鹽水稀釋10倍后以不同劑量（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mL原液）分別腹腔注射6組ICR小白鼠，每組4只；48h后觀察各組小白鼠死亡情況，確定ICR小白鼠LD100[13]。

1.3.3小白鼠免疫接種

取18～20g雌性小白鼠180只，隨機分成9組，每組20只，其中第1、第2、第3組皮下注射LTB-CPA、LTB-CPB2B1包涵體抗原各0.5mL，第4、第5、第6組小白鼠腹腔注射LTB-CPA、LTB-CPB2B1包涵體抗原各0.5mL，第7、第8組小白鼠腹腔注射CPA、CPB2B1包涵體氫氧化鋁膠體抗原0.5mL，第9組小白鼠皮下注射相同劑量生理鹽水（對照），間隔14d進行二免。

1.3.4小白鼠攻毒保護試驗

將毒素粗提物以1×LD100劑量分別對第1、第4、第7組免疫小白鼠進行攻毒，以2×LD100劑量對第2、第5、第8組免疫小白鼠進行攻毒，同時以1×LD100劑量注射對照組小白鼠，48h后觀察各組小白鼠的死亡情況，觀察免疫保護效果。

1.3.5解剖學檢查

取生理鹽水組攻毒死亡后的小白鼠和免疫組攻毒后未死亡的小白鼠，進行解剖觀察。

1.3.6LTB-CPA、LTB-CPB2B1融合蛋白免疫小白鼠免疫保護期初步測定

初次免疫56d后，將毒素粗提物以1×LD100劑量對第3、第6組免疫小白鼠腹腔注射進行攻毒，48h后觀察各組小白鼠死亡情況及免疫保護效果。

2結果與分析

2.1C型產氣莢膜梭菌毒素粗提物的制備及ICR小白鼠LD100的測定

將毒素粗提物用滅菌生理鹽水稀釋10倍后以不同劑量（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mL原液）分別腹腔注射6組ICR小白鼠，每組4只；48h后觀察各組小白鼠死亡情況，確定C型產氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清的LD100為0.05mL（表1）。

2.2重組菌株表達產物的小白鼠攻毒保護性分析結果

從表2可看出，LTB-CPA與LTB-CPB2B1融合蛋白聯合作用時對產氣莢膜梭菌毒素的保護效果很好，抵御1×LD100與2×LD100毒素攻擊時的保護率均達100%；與氫氧化鋁膠體作用化學佐劑添加組的保護效果相當。皮下免疫途徑與腹腔免疫途徑未發(fā)現有差異。從攻毒保護結果可看出，初次免疫56d后，用1×LD100劑量的C59-44強毒株毒素進行攻毒，免疫組小白鼠依然具有較高的保護率，與初免后28d攻毒保護率相差不大，表明該LTB-CPA及LTB-CPB2B1融合蛋白的免疫原性較好，LTB能誘發(fā)機體產生針對免疫抗原的長期免疫應答，對小白鼠免疫保護期至少為2個月。

2.3解剖學檢查結果

取生理鹽水組攻毒死亡后的小白鼠和免疫組攻毒后未死亡的小白鼠進行剖檢，結果顯示病變主要在回腸和空腸部分。攻毒死亡小白鼠腸壁脆弱、擴張、充滿氣體，內有黑褐色腸容物，可出現腸壁出血；對照組空腸腸壁菲薄，黏膜充血。而氫氧化鋁膠體佐劑組小腸雖未有病變，但脾臟腫大，組織間有粘連現象出現，而LTB作為免疫佐劑組與正常小白鼠結果沒有肉眼可見的差別（圖1）。

3結論與討論

隨著生物技術的發(fā)展，利用重組蛋白制備安全、高效及價廉的人或動物疫苗的研究正受到人們越來越廣泛的關注。產氣莢膜梭菌毒素是通過黏膜系統感染機體、動物及人體的小腸黏膜后引起機體一系列的毒性反應。而在機體黏膜微環(huán)境中會產生分泌型IgA（sIgA）及特異的免疫淋巴細胞，從而構成機體抵御病原體感染的第一道防線[12]。大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素是繼霍亂弧菌腸毒素CTB后發(fā)現的一種公認的新的強效黏膜免疫原和黏膜免疫佐劑，該毒素及其亞單位在過去20年中研究較廣[7]。其中，LTB與表達于細胞表面的GM1神經節(jié)苷脂及其受體有極高的親和力，在LT的免疫原性和佐劑作用中扮演著極其重要的角色[8]。

本試驗結果表明，LTB作為免疫佐劑與CPA或CPB1、CPB2融合時能促進免疫動物的黏膜細胞對目的抗原的攝取，發(fā)揮良好的免疫佐劑效應，從而使免疫動物抵御1×LD100與2×LD100毒素攻擊時的保護率均達到100%；與氫氧化鋁膠體作用化學佐劑添加組的保護效果相當。眾所周知，化學佐劑雖有加強抗原免疫應答的能力，但其本身的毒性也不容忽視，注射于動物機體中常常會在注射部位形成肉芽腫，若注射于腹腔，常會引起動物炎性反應而使組織器官粘連，免疫動物常常較為痛苦；而LTB本身即為蛋白，不但對機體的刺激性較小，而且可以作為產腸毒性大腸桿菌的部分抗原。本試驗選取了皮下免疫與腹腔免疫2種免疫途徑，但未發(fā)現二者有所差異，其原因有待深入研究。endprint

參考文獻：

[1]NiiloL.Clostridiumperfringensinanimaldisease：areviewofcurrentknowledge[J].CanVetJMay，1980，21（5）：141-148.

[2]許崇波，王玉炯，衛(wèi)廣森，等.C型產氣莢膜梭菌β毒素基因克隆與核苷酸序列分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，1999，21（2）：111-114.

[3]HunterSE，BrownJE，OystonPC，etal.Moleculargeneticanalysisofbeta-toxinofClostridiumperfringensrevealssequencehomologywithalpha-toxin，gamma-toxin，andleukocidinofStaphylococcusaureus[J].InfectImmunSep，1993，61（9）：3958-3965.

[4]GibertM，Jolivet-ReynaudC，PopoffMR.Beta-toxin，anoveltoxinproducedbyClostridiumperfringens[J].Gene，1997，203（1）：65-73.

[5]王玉炯，鄧光存，曾瑾，等.產氣莢膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析[J].寧夏大學學報：自然科學版，2004，25（1）：63-65.

[6]ZengJ，DengGC，WangJ，etal.PotentialprotectiveimmunogenicityofrecombinantClostridiumperfringensα-β2-β1fusiontoxininmice，sowsandcows[J].Vaccine，2011，29：5459-5466

[7]BoyakaPN，OhmuraM，FujihashiK，etal.ChimerasoflabiletoxinoneandcholeratoxinretainmucosaladjuvanticityanddirectThcellsubsetsviatheirBsubunit[J].JournalofImmunology，2003，170（1）：454-462.

[8]RicciS，MedagliniD，RushCM，etal.ImmunogenicityoftheBmonomerofEscherichiacoliheat-labiletoxinexpressedonthesurfaceofStreptococcusgordonii[J].InfectionandImmunity，2000，68（2）：760-766.

[9]RaskC，FredrikssonM，LindbladM，etal.Mucosalandsystemicantibodyresponsesafterperoralorintranasalimmunization：effectsofconjugationtoenterotoxinBsubunitsand/orofco-administrationwithfreetoxinasadjuvant[J].APMIS，2000，108（3）：178-186.

[10]WeltzinR，GuyB，ThomasWD，etal.ParenteraladjuvantactivitiesofEscherichiacoliheat-labiletoxinanditsBsubunitforimmunizationofmiceagainstgastricHelicobacterpyloriinfection[J].InfectionandImmunity，2000，68（5）：2775-2782.

[11]曾瑾，王玉炯，謝琴，等.產氣莢膜梭菌β2-β1毒素融合基因重組菌株免疫原性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（12）：62-63.

[12]SambrookJ，FritschEF，ManiatisT.Molecularcloning[M].NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989.

[13]WilliamsonED，TitballRW.Ageneticallyengineeredvaccineagainstthealpha-toxinofClostridiumperfringensprotectsmiceagainstexperimentalgasgangrene[J].VaccineSep，1993，11（12）：1253-1258.endprint

參考文獻：

[1]NiiloL.Clostridiumperfringensinanimaldisease：areviewofcurrentknowledge[J].CanVetJMay，1980，21（5）：141-148.

[2]許崇波，王玉炯，衛(wèi)廣森，等.C型產氣莢膜梭菌β毒素基因克隆與核苷酸序列分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，1999，21（2）：111-114.

[3]HunterSE，BrownJE，OystonPC，etal.Moleculargeneticanalysisofbeta-toxinofClostridiumperfringensrevealssequencehomologywithalpha-toxin，gamma-toxin，andleukocidinofStaphylococcusaureus[J].InfectImmunSep，1993，61（9）：3958-3965.

[4]GibertM，Jolivet-ReynaudC，PopoffMR.Beta-toxin，anoveltoxinproducedbyClostridiumperfringens[J].Gene，1997，203（1）：65-73.

[5]王玉炯，鄧光存，曾瑾，等.產氣莢膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析[J].寧夏大學學報：自然科學版，2004，25（1）：63-65.

[6]ZengJ，DengGC，WangJ，etal.PotentialprotectiveimmunogenicityofrecombinantClostridiumperfringensα-β2-β1fusiontoxininmice，sowsandcows[J].Vaccine，2011，29：5459-5466

[7]BoyakaPN，OhmuraM，FujihashiK，etal.ChimerasoflabiletoxinoneandcholeratoxinretainmucosaladjuvanticityanddirectThcellsubsetsviatheirBsubunit[J].JournalofImmunology，2003，170（1）：454-462.

[8]RicciS，MedagliniD，RushCM，etal.ImmunogenicityoftheBmonomerofEscherichiacoliheat-labiletoxinexpressedonthesurfaceofStreptococcusgordonii[J].InfectionandImmunity，2000，68（2）：760-766.

[9]RaskC，FredrikssonM，LindbladM，etal.Mucosalandsystemicantibodyresponsesafterperoralorintranasalimmunization：effectsofconjugationtoenterotoxinBsubunitsand/orofco-administrationwithfreetoxinasadjuvant[J].APMIS，2000，108（3）：178-186.

[10]WeltzinR，GuyB，ThomasWD，etal.ParenteraladjuvantactivitiesofEscherichiacoliheat-labiletoxinanditsBsubunitforimmunizationofmiceagainstgastricHelicobacterpyloriinfection[J].InfectionandImmunity，2000，68（5）：2775-2782.

[11]曾瑾，王玉炯，謝琴，等.產氣莢膜梭菌β2-β1毒素融合基因重組菌株免疫原性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（12）：62-63.

[12]SambrookJ，FritschEF，ManiatisT.Molecularcloning[M].NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989.

[13]WilliamsonED，TitballRW.Ageneticallyengineeredvaccineagainstthealpha-toxinofClostridiumperfringensprotectsmiceagainstexperimentalgasgangrene[J].VaccineSep，1993，11（12）：1253-1258.endprint

參考文獻：

[1]NiiloL.Clostridiumperfringensinanimaldisease：areviewofcurrentknowledge[J].CanVetJMay，1980，21（5）：141-148.

[2]許崇波，王玉炯，衛(wèi)廣森，等.C型產氣莢膜梭菌β毒素基因克隆與核苷酸序列分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，1999，21（2）：111-114.

[3]HunterSE，BrownJE，OystonPC，etal.Moleculargeneticanalysisofbeta-toxinofClostridiumperfringensrevealssequencehomologywithalpha-toxin，gamma-toxin，andleukocidinofStaphylococcusaureus[J].InfectImmunSep，1993，61（9）：3958-3965.

[4]GibertM，Jolivet-ReynaudC，PopoffMR.Beta-toxin，anoveltoxinproducedbyClostridiumperfringens[J].Gene，1997，203（1）：65-73.

[5]王玉炯，鄧光存，曾瑾，等.產氣莢膜梭菌的β2毒素基因克隆及其核苷酸序列分析[J].寧夏大學學報：自然科學版，2004，25（1）：63-65.

[6]ZengJ，DengGC，WangJ，etal.PotentialprotectiveimmunogenicityofrecombinantClostridiumperfringensα-β2-β1fusiontoxininmice，sowsandcows[J].Vaccine，2011，29：5459-5466

[7]BoyakaPN，OhmuraM，FujihashiK，etal.ChimerasoflabiletoxinoneandcholeratoxinretainmucosaladjuvanticityanddirectThcellsubsetsviatheirBsubunit[J].JournalofImmunology，2003，170（1）：454-462.

[8]RicciS，MedagliniD，RushCM，etal.ImmunogenicityoftheBmonomerofEscherichiacoliheat-labiletoxinexpressedonthesurfaceofStreptococcusgordonii[J].InfectionandImmunity，2000，68（2）：760-766.

[9]RaskC，FredrikssonM，LindbladM，etal.Mucosalandsystemicantibodyresponsesafterperoralorintranasalimmunization：effectsofconjugationtoenterotoxinBsubunitsand/orofco-administrationwithfreetoxinasadjuvant[J].APMIS，2000，108（3）：178-186.

[10]WeltzinR，GuyB，ThomasWD，etal.ParenteraladjuvantactivitiesofEscherichiacoliheat-labiletoxinanditsBsubunitforimmunizationofmiceagainstgastricHelicobacterpyloriinfection[J].InfectionandImmunity，2000，68（5）：2775-2782.

[11]曾瑾，王玉炯，謝琴，等.產氣莢膜梭菌β2-β1毒素融合基因重組菌株免疫原性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（12）：62-63.

[12]SambrookJ，FritschEF，ManiatisT.Molecularcloning[M].NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989.

[13]WilliamsonED，TitballRW.Ageneticallyengineeredvaccineagainstthealpha-toxinofClostridiumperfringensprotectsmiceagainstexperimentalgasgangrene[J].VaccineSep，1993，11（12）：1253-1258.endprint