于麗穎+成樂琴

摘要：以水解前后大豆異黃酮糖苷含量變化計(jì)算水解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)法對(duì)水解的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元最佳工藝為：反應(yīng)溫度127℃，反應(yīng)時(shí)間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達(dá)到90%以上。

關(guān)鍵詞：大豆異黃酮糖苷；大豆異黃酮苷元；水解；檸檬酸；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：O629.13文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0294-03

大豆異黃酮的健康功效多種多樣，可以預(yù)防多種疾病和改善骨健康狀況[1]。大豆中天然存在的異黃酮包括大豆異黃酮糖苷和大豆異黃酮苷元2類，其中，大豆異黃酮糖苷占到了總異黃酮含量的80%～95%，糖苷型大豆異黃酮由于分子較大，食用后不能被人體直接吸收，一般是在體內(nèi)消化酶作用下轉(zhuǎn)化為苷元被人體吸收，因此大豆異黃酮的生物活性主要是苷元，而不是糖苷，但目前各種類型保健品大豆異黃酮主要成分是糖苷，資料顯示，體內(nèi)消化酶一般水解率在20%～40%，產(chǎn)品功效較低[2-3]。另外，每個(gè)人腸道消化酶不太一樣，即使食用同樣的大豆異黃酮，個(gè)體間效果相差很大。因此體外水解工藝開發(fā)就具有實(shí)際意義。

目前，大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化苷元的方法最常用的是酸催化法、堿催化法、酶催化法[4-6]。酸水解法是大豆異黃酮糖苷水解中使用最多的一種方法。酸水解通常用鹽酸、硫酸作催化劑，強(qiáng)酸條件下水解會(huì)影響大豆異黃酮苷元的穩(wěn)定性。糖苷鍵具有縮醛結(jié)構(gòu)，對(duì)堿較穩(wěn)定，異黃酮糖苷鍵具有酯苷性質(zhì)，可用堿水解為大豆異黃酮苷元和葡萄糖，堿催化產(chǎn)物苷元容易降解，應(yīng)用受到很大限制。酶水解法具有水解條件溫和，產(chǎn)物穩(wěn)定性好，純度高等特點(diǎn)，但酶生產(chǎn)成本很高，而且酶不容易重復(fù)利用。工業(yè)生產(chǎn)中還需要進(jìn)一步尋找廉價(jià)又高效能夠水解大豆異黃酮的β-葡萄糖苷酶，并進(jìn)一步研究低成本酶固化技術(shù)。

檸檬酸是人體內(nèi)部循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，易被人體吸收，因此作為性能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)療和保健品等領(lǐng)域。用檸檬酸做催化劑來催化大豆異黃酮糖苷的水解，避免目前工業(yè)上采用酸、堿等水解方法對(duì)設(shè)備的腐蝕，水解產(chǎn)物無需分離直接用于功能性食品，能夠?qū)o效或低效成分大豆異黃酮糖苷變?yōu)橛行Ш透咝С煞执蠖巩慄S酮苷元，增強(qiáng)了大豆異黃酮的生物活性，彌補(bǔ)了現(xiàn)有大豆異黃酮轉(zhuǎn)化苷元工藝中選用鹽酸催化、堿催化和酶催化等技術(shù)缺陷，因此是一條應(yīng)用價(jià)值較高工藝路線。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大豆異黃酮糖苷標(biāo)樣：大豆苷，黃豆黃苷、染料木苷（天津馬克生物有限公司公司），含量超過98%。糖苷型大豆異黃酮提取物（西安金綠生物工程公司），含量為91.3%。甲醇為色譜純，檸檬酸（AR），乙醚（AR）。

1.2主要儀器

高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；分析天平（北京醫(yī)用天平廠）；CS101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；KQ-250VDE型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3試驗(yàn)步驟

稱取大豆異黃酮糖苷50mg置于50mL圓底燒瓶中，加入一定濃度檸檬酸水溶液10mL，超聲水浴1h，超聲頻率45kHz，水浴溫度75℃。反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，反應(yīng)溫度為110～130℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～2h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液至室溫。取一定量反應(yīng)液用飽和碳酸鈉水溶液中和至pH值=7，用乙酸乙酯萃取，取酯層，在硅膠板上點(diǎn)樣，放入展開劑（乙酸乙酯∶三氯甲烷∶甲醇=5∶5∶2）中展開，紫外燈下觀察水解程度；另取一定量反應(yīng)液用甲醇稀釋到100mg/L，過0.45μm濾膜后上機(jī)，用HPLC定性和定量檢測(cè)反應(yīng)液中糖苷的含量。

1.4高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定糖苷及其苷元的含量

1.4.1色譜條件

色譜柱：ShimadzuVP-ODSC18柱，150mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相：A為0.4%磷酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～10min，30%～35%B；10～20min，35%～40%B；20～30min，40%～55%B；30～40min，55%～65%B；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為：260nm，測(cè)定溫度為30℃；進(jìn)樣量：20μL。

根據(jù)糖苷和苷元化學(xué)性質(zhì)的不同，從色譜柱中流出的先后順序不同，經(jīng)紫外檢測(cè)器測(cè)定，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，外標(biāo)法計(jì)算。

大豆異黃酮糖苷水解率=水解前后大豆異黃酮糖苷含量之差/水解前大豆異黃酮糖苷含量×100%。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取一定量大豆異黃酮糖苷標(biāo)準(zhǔn)品于100mL的容量瓶中，用甲醇超聲溶解30min，再用甲醇定容至刻度線，搖勻，分別精確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5mL，用甲醇定容至25mL，配制成10、20、30、40、50μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，備用。

用HPLC法分別測(cè)定配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量20μL，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積A對(duì)濃度C（μg/mL）進(jìn)行回歸分析，得到線性方程。

回歸方程分別為：

大豆苷：A=78.576C+39.121，r=0.9999；

黃豆黃苷：A=69.321C+33.867，r=0.9998；

染料木苷：A=99.671C+35.586，r=0.9999。

式中：A為大豆異黃酮的峰面積：C為大豆異黃酮的濃度，μg/mL，線性范圍是10～50μg/mL。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同反應(yīng)溫度對(duì)大豆異黃酮水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，檸檬酸催化劑濃度為1.6mol/L，溶劑用量為10mL，反應(yīng)時(shí)間為2h，改變反應(yīng)溫度，探索不同反應(yīng)溫度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，隨著溫度增加，水解率逐漸增加。當(dāng)反應(yīng)溫度為125℃，水解率達(dá)到90.5%，一般大豆異黃酮糖苷在人體消化酶作用下，水解率為20%左右，大豆異黃酮糖苷水解率達(dá)到90%更具有實(shí)際意義。因此，在單因素水解反應(yīng)試驗(yàn)中，適宜溫度為125℃。為了進(jìn)一步考察反應(yīng)溫度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應(yīng)溫度分別為123、125、127℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。endprint

2.1.2不同檸檬酸水溶液濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，反應(yīng)溫度為125℃，反應(yīng)時(shí)間為2h，溶劑用量為10mL，改變催化劑檸檬酸水溶液的濃度，探索催化劑濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，隨催化劑檸檬酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加；當(dāng)檸檬酸濃度為1.6mol/L時(shí)，水解率為90.5%。再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，檸檬酸為有機(jī)弱酸，適宜的濃度酸性較強(qiáng)，濃度過大會(huì)抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的檸檬酸濃度為1.6mol/L。為了進(jìn)一步考察催化劑濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇檸檬酸濃度分別為1.4、1.6、1.8mol/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，催化劑濃度為1.8mol/L，反應(yīng)溫度為125℃，溶劑用量為10mL，改變反應(yīng)時(shí)間，探索不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，隨反應(yīng)時(shí)間增加，水解率也逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1.6h，水解率接近90%，延長(zhǎng)時(shí)間，水解率變化不大。為了進(jìn)一步考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應(yīng)時(shí)間分別為1.4、1.6、1.8h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，大豆異黃酮糖苷水解苷元主要影響因素包括催化劑濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，根據(jù)正交試驗(yàn)影響因素構(gòu)建正交試驗(yàn)表進(jìn)一步確立水解反應(yīng)的最佳工藝條件。

2.2.1因素及水平的考察

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水

解率為考察指標(biāo)，選擇反應(yīng)時(shí)間（1.4、1.6、1.8h）、反應(yīng)溫度（123、125、127℃）、檸檬酸濃度（1.4、1.6、1.8mol/L）、作為考察因素，按3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（43），見表4，在此條件下對(duì)大豆異黃酮糖苷按“1.3”節(jié)方法進(jìn)行水解，按“1.4”節(jié)方法，用HPLC定性和定量檢測(cè)反應(yīng)液糖苷及其苷元的含量，計(jì)算水解率，確定大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝。

2.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。從表5的極差分析結(jié)果可知，3因素對(duì)水解率的影響程度依次為B>A>C，3因素的最佳水平組合為A3B3C2，即檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度127℃，反應(yīng)時(shí)間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達(dá)到90%以上。表6的方差分析結(jié)果表明，水解溫度和水解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.3最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為了考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按該工藝條件重復(fù)提取3次，測(cè)得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為92.8%、91.3%、92.5%，平均為92.2%，表明本試驗(yàn)優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出各因素對(duì)水解效果影響的主次順序依次為反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>檸檬酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應(yīng)溫度對(duì)水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應(yīng)溫度127℃，反應(yīng)時(shí)間1.8h，催化劑檸檬酸水溶液濃度1.6mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達(dá)到90%以上。

本研究成功探索出一條簡(jiǎn)便、清潔、成本較低，水解產(chǎn)物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補(bǔ)了現(xiàn)有工藝中的技術(shù)缺陷，因此實(shí)用性較高。

參考文獻(xiàn)：

[1]KuoLC，LeeKT.Cloning，Expression，andcharacterizationoftwobeta-glucosidasesfromisoflavoneglycoside-hydrolyzingBacillussubtilis（natto）[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56（1）：119-125.

[2]KawakamiY，TsurugasakiW，NakamuraS，etal.Comparisonofregulativefunctionsbetweendietarysoyisoflavonesaglyconeandglucosideonlipidmetabolisminratsfedcholesterol[J].TheJournalofNutritionalBiochemistry，2005，16（4）：205-212.

[3]SetchellKR，CassidyA.Dietaryisofravones：biologicaleffectsandrelevancetohumanhealthy[J].JournalofNutrition，1999，129：758-767.

[4]高榮海，鄭艷，劉長(zhǎng)江.大豆異黃酮糖苷酸法水解工藝的研究[J].糧食加工，2008，33（1）：54-57.

[5]孫艷梅，張永忠，許晶，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（1）：9-12.

[6]王林山.大豆異黃酮的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2004（11）：18-21.endprint

2.1.2不同檸檬酸水溶液濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，反應(yīng)溫度為125℃，反應(yīng)時(shí)間為2h，溶劑用量為10mL，改變催化劑檸檬酸水溶液的濃度，探索催化劑濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，隨催化劑檸檬酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加；當(dāng)檸檬酸濃度為1.6mol/L時(shí)，水解率為90.5%。再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，檸檬酸為有機(jī)弱酸，適宜的濃度酸性較強(qiáng)，濃度過大會(huì)抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的檸檬酸濃度為1.6mol/L。為了進(jìn)一步考察催化劑濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇檸檬酸濃度分別為1.4、1.6、1.8mol/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，催化劑濃度為1.8mol/L，反應(yīng)溫度為125℃，溶劑用量為10mL，改變反應(yīng)時(shí)間，探索不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，隨反應(yīng)時(shí)間增加，水解率也逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1.6h，水解率接近90%，延長(zhǎng)時(shí)間，水解率變化不大。為了進(jìn)一步考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應(yīng)時(shí)間分別為1.4、1.6、1.8h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，大豆異黃酮糖苷水解苷元主要影響因素包括催化劑濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，根據(jù)正交試驗(yàn)影響因素構(gòu)建正交試驗(yàn)表進(jìn)一步確立水解反應(yīng)的最佳工藝條件。

2.2.1因素及水平的考察

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水

解率為考察指標(biāo)，選擇反應(yīng)時(shí)間（1.4、1.6、1.8h）、反應(yīng)溫度（123、125、127℃）、檸檬酸濃度（1.4、1.6、1.8mol/L）、作為考察因素，按3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（43），見表4，在此條件下對(duì)大豆異黃酮糖苷按“1.3”節(jié)方法進(jìn)行水解，按“1.4”節(jié)方法，用HPLC定性和定量檢測(cè)反應(yīng)液糖苷及其苷元的含量，計(jì)算水解率，確定大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝。

2.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。從表5的極差分析結(jié)果可知，3因素對(duì)水解率的影響程度依次為B>A>C，3因素的最佳水平組合為A3B3C2，即檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度127℃，反應(yīng)時(shí)間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達(dá)到90%以上。表6的方差分析結(jié)果表明，水解溫度和水解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.3最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為了考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按該工藝條件重復(fù)提取3次，測(cè)得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為92.8%、91.3%、92.5%，平均為92.2%，表明本試驗(yàn)優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出各因素對(duì)水解效果影響的主次順序依次為反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>檸檬酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應(yīng)溫度對(duì)水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應(yīng)溫度127℃，反應(yīng)時(shí)間1.8h，催化劑檸檬酸水溶液濃度1.6mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達(dá)到90%以上。

本研究成功探索出一條簡(jiǎn)便、清潔、成本較低，水解產(chǎn)物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補(bǔ)了現(xiàn)有工藝中的技術(shù)缺陷，因此實(shí)用性較高。

參考文獻(xiàn)：

[1]KuoLC，LeeKT.Cloning，Expression，andcharacterizationoftwobeta-glucosidasesfromisoflavoneglycoside-hydrolyzingBacillussubtilis（natto）[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56（1）：119-125.

[2]KawakamiY，TsurugasakiW，NakamuraS，etal.Comparisonofregulativefunctionsbetweendietarysoyisoflavonesaglyconeandglucosideonlipidmetabolisminratsfedcholesterol[J].TheJournalofNutritionalBiochemistry，2005，16（4）：205-212.

[3]SetchellKR，CassidyA.Dietaryisofravones：biologicaleffectsandrelevancetohumanhealthy[J].JournalofNutrition，1999，129：758-767.

[4]高榮海，鄭艷，劉長(zhǎng)江.大豆異黃酮糖苷酸法水解工藝的研究[J].糧食加工，2008，33（1）：54-57.

[5]孫艷梅，張永忠，許晶，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（1）：9-12.

[6]王林山.大豆異黃酮的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2004（11）：18-21.endprint

2.1.2不同檸檬酸水溶液濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，反應(yīng)溫度為125℃，反應(yīng)時(shí)間為2h，溶劑用量為10mL，改變催化劑檸檬酸水溶液的濃度，探索催化劑濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，隨催化劑檸檬酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加；當(dāng)檸檬酸濃度為1.6mol/L時(shí)，水解率為90.5%。再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，檸檬酸為有機(jī)弱酸，適宜的濃度酸性較強(qiáng)，濃度過大會(huì)抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的檸檬酸濃度為1.6mol/L。為了進(jìn)一步考察催化劑濃度對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇檸檬酸濃度分別為1.4、1.6、1.8mol/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響

固定大豆異黃酮糖苷的量為50mg，催化劑濃度為1.8mol/L，反應(yīng)溫度為125℃，溶劑用量為10mL，改變反應(yīng)時(shí)間，探索不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解苷元水解率的影響。試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，隨反應(yīng)時(shí)間增加，水解率也逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1.6h，水解率接近90%，延長(zhǎng)時(shí)間，水解率變化不大。為了進(jìn)一步考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應(yīng)時(shí)間分別為1.4、1.6、1.8h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，大豆異黃酮糖苷水解苷元主要影響因素包括催化劑濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，根據(jù)正交試驗(yàn)影響因素構(gòu)建正交試驗(yàn)表進(jìn)一步確立水解反應(yīng)的最佳工藝條件。

2.2.1因素及水平的考察

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水

解率為考察指標(biāo)，選擇反應(yīng)時(shí)間（1.4、1.6、1.8h）、反應(yīng)溫度（123、125、127℃）、檸檬酸濃度（1.4、1.6、1.8mol/L）、作為考察因素，按3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（43），見表4，在此條件下對(duì)大豆異黃酮糖苷按“1.3”節(jié)方法進(jìn)行水解，按“1.4”節(jié)方法，用HPLC定性和定量檢測(cè)反應(yīng)液糖苷及其苷元的含量，計(jì)算水解率，確定大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝。

2.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。從表5的極差分析結(jié)果可知，3因素對(duì)水解率的影響程度依次為B>A>C，3因素的最佳水平組合為A3B3C2，即檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度127℃，反應(yīng)時(shí)間為1.8h，檸檬酸水溶液濃度為1.6mol/L，水解率達(dá)到90%以上。表6的方差分析結(jié)果表明，水解溫度和水解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.3最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為了考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按該工藝條件重復(fù)提取3次，測(cè)得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為92.8%、91.3%、92.5%，平均為92.2%，表明本試驗(yàn)優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化檸檬酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出各因素對(duì)水解效果影響的主次順序依次為反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>檸檬酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應(yīng)溫度對(duì)水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應(yīng)溫度127℃，反應(yīng)時(shí)間1.8h，催化劑檸檬酸水溶液濃度1.6mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達(dá)到90%以上。

本研究成功探索出一條簡(jiǎn)便、清潔、成本較低，水解產(chǎn)物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補(bǔ)了現(xiàn)有工藝中的技術(shù)缺陷，因此實(shí)用性較高。

參考文獻(xiàn)：

[1]KuoLC，LeeKT.Cloning，Expression，andcharacterizationoftwobeta-glucosidasesfromisoflavoneglycoside-hydrolyzingBacillussubtilis（natto）[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56（1）：119-125.

[2]KawakamiY，TsurugasakiW，NakamuraS，etal.Comparisonofregulativefunctionsbetweendietarysoyisoflavonesaglyconeandglucosideonlipidmetabolisminratsfedcholesterol[J].TheJournalofNutritionalBiochemistry，2005，16（4）：205-212.

[3]SetchellKR，CassidyA.Dietaryisofravones：biologicaleffectsandrelevancetohumanhealthy[J].JournalofNutrition，1999，129：758-767.

[4]高榮海，鄭艷，劉長(zhǎng)江.大豆異黃酮糖苷酸法水解工藝的研究[J].糧食加工，2008，33（1）：54-57.

[5]孫艷梅，張永忠，許晶，等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（1）：9-12.

[6]王林山.大豆異黃酮的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2004（11）：18-21.endprint