楊宏靜， 陳 瑛， 方應(yīng)權(quán)

（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶404120）

HPLC法同時(shí)測(cè)定五味消毒飲中4種成分

楊宏靜， 陳 瑛*， 方應(yīng)權(quán)

（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶404120）

目的建立HPLC法同時(shí)測(cè)定五味消毒飲中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素4種活性成分。方法五味消毒飲水提液分析采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0μm），以0.05%三氟乙酸溶液（V/V）-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm和344 nm，柱溫30℃。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的線性范圍分別為4.96～49.6μg/mL，0.255～2.55μg/mL，2.51～25.1μg/mL和2.47～24.7 μg/mL（r≥0.999 8）。平均回收率在95%～105%范圍內(nèi)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可作為五味消毒飲的質(zhì)量控制方法。

五味消毒飲；測(cè)定；綠原酸；咖啡酸；蒙花苷；秦皮乙素

五味消毒飲出自 《醫(yī)宗金鑒》，由金銀花20 g，野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天癸子各15 g組成，具有清熱解毒、消散疔瘡等功效，本方為治療疔毒的常用名方，臨床上廣泛用于內(nèi)科、外科、五官科、婦科等疾患［1-3］。綠原酸為金銀花、野菊花和蒲公英的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、保肝利膽作用［4-5］。金銀花和蒲公英中含有的咖啡酸具有抗菌、抗病毒、止血、提高中樞興奮性和免疫促進(jìn)等作用［2，6］。蒙花苷是野菊花中含有量較高的黃酮類成分，具有保護(hù)心腦血管、利膽保肝、抗癌、抗氧化等多種生物活性［7-8］。紫花地丁中的秦皮乙素是一種內(nèi)酯類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用［9-10］。目前關(guān)于五味消毒飲中有效成分的測(cè)定僅集中于綠原酸和咖啡酸［2，11］。本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定五味消毒飲中的綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的量，為更好地對(duì)五味消毒飲進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀：二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、柱溫箱等、Agilent ChemStation B.04.02工作站（美國(guó)Agilent公司）。AS3120型超聲波清洗器 （奧特恩斯儀器有限公司），XS205DU電子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）。

五味消毒飲各味藥材均購(gòu)自重慶市中藥材公司，經(jīng)由三峽中藥研究所付紹智教授鑒定，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［3］。并按文獻(xiàn) ［3］方法制成五味消毒飲提取物（相當(dāng)于含生藥量1.0 g/mL）。

綠原酸 （批號(hào)130885-200103），咖啡酸 （批號(hào) 130753-200415）， 蒙 花 苷 （批 號(hào) 121383-200216），秦皮乙素 （批號(hào)125069-210216）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5.0μm），流動(dòng)相A為0.05%三氟乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫 （0～20 min，5～16%B；20～30 min，16%B；30～40 min，16%～22%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm（0～35 min），344 nm（35～40 nm）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素對(duì)照品適量，置同一量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品貯備溶液，分別為綠原酸4.96 mg/m L、咖啡酸0.255 mg/mL、蒙花苷2.51 mg/mL、秦皮乙素2.47 mg/mL。

2.3 供試品溶液的制備 參考文獻(xiàn)方法［2］，精密吸取供試品1 mL至100 mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，混勻，用孔徑為0.22μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 本研究中，金銀花、野菊花和蒲公英含有綠原酸；金銀花和蒲公英中含有咖啡酸；野菊花中含有蒙花苷；紫花地丁含有秦皮乙素。按處方比例分別制備缺上述藥材的陰性供試品，并按照 “2.3”項(xiàng)下方法分別制備陰性供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系 分別精密吸取 “2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品貯備溶液5 m L至50 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，再分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mL至50 mL量瓶中，以50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20μL進(jìn)樣，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積值Y對(duì)質(zhì)量濃度X（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得五味消毒飲中4個(gè)活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù) （r）和線性范圍，見表1。

表1 五味消毒飲中4種活性成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of four active com ponents in W uwei Xiaodu Drink

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、秦皮乙素的峰面積RSD值分別為1.6%、1.3%、0.58%和0.85%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批五味消毒飲 （批號(hào)20130501）6份，按 “2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將測(cè)定綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的峰面積代入 “2.5”項(xiàng)下的回歸方程，計(jì)算。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的RSD分別為1.1%、1.2%、0.98%、1.3%，表明方法的重復(fù)性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取五味消毒飲1 m L，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，按照 “2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素峰面積RSD值分別為1.5%、1.9%、0.85%和1.4%，表明在室溫條件下，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知各成分含有量的供試品 （批號(hào)20130501）6份，每份1.0 mL，分別精密加入一定量的綠原酸（49.6 mg/mL）、咖啡酸（2.55 mg/mL）、蒙花苷（25.1 mg/mL）和秦皮乙素（24.7 mg/mL）對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，即得。結(jié)果見表2。

2.10 樣品的測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備不同批號(hào)的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，外標(biāo)法計(jì)算綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的量，結(jié)果見表3。

3 討論

中藥化學(xué)成分呈多樣性和復(fù)雜性，對(duì)于復(fù)方制劑，在定量指標(biāo)上應(yīng)盡可能選擇多指標(biāo)控制其質(zhì)量［12］。本研究在前期工作［11］和文獻(xiàn)［2］基礎(chǔ)上，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定五味消毒飲中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素，方法簡(jiǎn)便、可靠、靈敏，為建立和完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

根據(jù)文獻(xiàn) ［12-15］，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)，以水、磷酸溶液和三氟乙酸溶液作為水相，甲醇和乙腈作為有機(jī)相，考察了各種流動(dòng)相組合對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果顯示，以0.05%三氟乙酸溶液-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，所測(cè)各成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，色譜峰對(duì)稱性良好，理論塔板數(shù)以秦皮乙素計(jì)不低于4 000。

表2 加樣回收率Tab.2 Results of recovery tests

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 （，n=3）Tab.3 Determ ination results of sam p les（，n=3）

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 （，n=3）Tab.3 Determ ination results of sam p les（，n=3）

批號(hào) 綠原酸/（mg·m L-1）咖啡酸/（mg·mL-1）蒙花苷/（mg·m L-1）秦皮乙素/（mg·m L-1）20130501 1.96±0.05 0.108±0.01 0.982±0.07 0.956±0.07 20130503 1.85±0.12 0.121±0.02 0.965±0.10 0.112±0.10 20130505 1.91±0.07 0.115±0.02 0.102±0.09 0.981±0.15

經(jīng)全波長(zhǎng)掃描，并結(jié)合文獻(xiàn)，綠原酸、咖啡酸［13］和蒙花苷［14］在320 nm波長(zhǎng)均有明顯吸收，且雜質(zhì)干擾少。秦皮乙素在344 nm處有最大吸收［15］。利用檢測(cè)器可變波長(zhǎng)的性能，每次進(jìn)樣測(cè)定時(shí)，0～35min設(shè)定波長(zhǎng)為320 nm，測(cè)定綠原酸、咖啡酸和蒙花苷，35～40 min波長(zhǎng)設(shè)為344 nm，測(cè)定秦皮乙素。

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Sim ultaneous determ ination of four active com ponents from W uwei Xiaodu Drink

YANG Hong-jing， CHEN Ying*， FANG Ying-quan

（Department of Pharmacy，Chongqing Three GorgesMedical College，Chongqing 404120，China）

AIMTo establish an HPLCmethod for simultaneously determining chlorogenic acid，caffeic acid，linarin，and aesculetin from Wuwei Xiaodu Drink.METHODSThe analysis of aqueous extract ofWuwei Xiaodu Drink was performed on Agilent Eclipse XDB-C18column（250 mm×4.6 mm，5.0μm）with mobile phase consisting of 0.05%（V/V）trifluoroacetic acid-acetonitrile in a gradient elution mode.The wavelength was set at 320 nm and 344 nm for different components.Flow ratewas1.0mL/min and column temperature wasmaintaned at 30℃.RESULTSThe linear ranges of chlorogenic acid，caffeic acid，linarin，and aesculetin were 4.96-49.6μg/mL，0.255-2.55μg/mL，2.51-25.1μg/mL，and 2.47-24.7μg/m L（r≥0.999 8），respectively.The average recoverieswere between 95%～105%.CONLUSIONThemethod issimple，sensible，accurate and can be used for the quality control ofWuwei Xiaodu Drink.

Wuwei Xiaodu Drink；determination；chlorogenic acid；caffeic acid；linarin；aesculetin

R927.2

A

1001-1528（2015）04-0778-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.018

2014-05-19

重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （2011xz09）

楊宏靜 （1969—），男，碩士，講師，研究方向?yàn)橹形魉幝?lián)合應(yīng)用。Tel：13896286555

*通信作者：陳 瑛 （1963—），女，副教授，研究方向?yàn)橛袡C(jī)化學(xué)。Tel：（0433）58556103，E-mail：601861207@qq.com

日期：2014-07-31

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