■姜旭陽 高 雁 張 紅 苗暢齊柳廣昊韓 英趙 鵬

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機械研究所有限公司，遼寧沈陽 110036；3.北鎮(zhèn)市常興店動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧北鎮(zhèn) 121306）

熱休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）通常被用作多種應(yīng)激因子的生物標記，例如溫度變化、組織損傷、毒物暴露、饑餓、鹽度變化以及病毒感染等[1-4]。在應(yīng)激狀態(tài)下，機體產(chǎn)生多種類型的Hsp。Hsp通過阻止外源蛋白質(zhì)聚合、促進新合成蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定并重新折疊受損蛋白等途徑，在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用[5]。在Hsp家族中，Hsp60在蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并具有對破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的應(yīng)激進行應(yīng)答的能力[6]。

近年來，重金屬污染日趨嚴重，已經(jīng)成為全球性的問題。大量的研究顯示，人類的活動，例如工業(yè)污水排放、采礦和廢氣排放等[7]，導(dǎo)致了生態(tài)環(huán)境中重金屬濃度的升高[8]，我國作為農(nóng)業(yè)大國，重金屬污染對農(nóng)產(chǎn)品的影響不容忽視，2013年發(fā)生的“鎘大米”事件為我們敲響了警鐘。重金屬通過污染水環(huán)境和土壤，導(dǎo)致魚類及農(nóng)作物中重金屬含量超標，人類和家畜食用后必然會對健康造成危害。魚類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，極易受到重金屬污染的影響，同時魚粉作為重要的動物性蛋白添加飼料之一，在飼料行業(yè)應(yīng)用廣泛。因此，如何避免重金屬進入生態(tài)循環(huán)已成為研究的熱點。鯉是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要品種，同時也是近幾年興起的“稻田養(yǎng)魚”養(yǎng)殖模式的主要對象之一。銅和鎘是水體中非常常見的重金屬，二者對水生生物的毒性研究已經(jīng)很多，但是分子和蛋白水平的研究依然比較缺乏。選取鯉作為試驗動物，探究銅和鎘亞急性暴露對其肝臟中熱休克蛋白60（Hsp60）表達的影響，從而為評估這兩種重金屬對鯉的亞急性毒性作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚及管理

健康鯉購于黑龍江省哈爾濱市某淡水魚養(yǎng)殖基地，飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室。試驗魚平均體重(45.3±6.7)g，體長(13.5±1.5)cm。在進行暴露試驗之前，飼養(yǎng)于220 L水族箱14 d。每天投喂兩次，每天換水一次，換水量為1/2，水溫(20±1)℃。水族箱持續(xù)曝氣，水中溶解氧高于7 mg/l，pH值為7.3±0.3，總硬度230 mg/l（以CaCO3計），每天光照12 h。

1.1.2 試驗設(shè)計

隨機選擇健康鯉，分為如下7組：兩個Cu2+處理組（0.05 mg/l和0.1 mg/l），兩個Cd2+處理組（0.63 mg/l和1.26 mg/l），兩個混合處理組（0.045 mg/l和0.09 mg/l）和一個對照組。每個處理組30尾魚，并設(shè)置兩個平行。二者的混合物由Cu2+和Cd2+按質(zhì)量比1∶1組成。CuSO4·5H2O(AR)和 CdCl2·2.5H2O(AR)購于 Sig?ma-Aldrich(USA)公司。試驗中的濃度根據(jù)Cu2+和Cd2+對鯉的96 h LC50的1/4和1/2而設(shè)置。Cu2+和Cd2+對鯉的96 h LC50的1/4和1/2在之前的研究中報道過[9-10]。我們通過預(yù)試驗獲得了二者混合物的96 h LC50。

1.1.3 采樣

在重金屬暴露的24、48、72 h和96 h時，每個處理組取5尾魚，快速取出肝臟，放置于液氮中，最后凍存于-80℃冰箱中。

1.2 基因表達分析

1.2.1 引物設(shè)計與合成

以β-actin mRNA（基因登錄序列AF057040）作為內(nèi)參，根據(jù)GenBank中鯉魚的Hsp60基因登陸序列（BC068415），用Oligo6.0軟件進行引物設(shè)計(見表1)。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 鯉Hsp60基因表達所用的引物

1.2.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成

鯉肝臟總RNA的提取按照Trizol試劑盒說明書進行，cDNA第一鏈利用oligodT引物和Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶從5 μg總RNA中合成，并稀釋5倍，保存于-80℃冰箱中。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

總 RNA 10 μg，加 OligodT 2 μl，加 0.1%DEPC水至總體積為22 μl，70℃作用10 min，取出后立即放在冰上進行反轉(zhuǎn)錄：M-MLV 1 μl，RNase Inhibitor 1 μl，dNTP 4 μl，5×Buffer 8 μl，0.1 M DTT 4 μl；37 ℃水浴1～2 h，70℃下加熱 15 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實時定量PCR擴增

用設(shè)計好的實時定量PCR引物分別擴增目的基因。定量 PCR反應(yīng)采用 SYBR GreenⅠ熒光染料法。20 μl反應(yīng)體系見表2。

反應(yīng)在ABI 7500 Real Time PCR System上進行。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 30 s，95℃ 5 s，60℃34 s，40個循環(huán)，最后為融解反應(yīng)（dissociation stage）。反應(yīng)所獲得的擴增曲線和融解曲線用Disso?ciation Curve 1.0軟件進行分析。mRNA相對豐度通過 Pfaffl方法計算[11]。

表2 PCR反應(yīng)體系

1.3 Western blot分析

收集蛋白提取物，進行SDS-PAGE電泳。把電泳分離的蛋白進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為：20%甲醇的Tris-glycine緩沖溶液中，100 mA進行電轉(zhuǎn)2 h。后經(jīng)過 5%脫脂奶粉封閉 16～24 h，并孵育Hsp60蛋白一抗（1∶100）過夜，隨即進行辣根過氧化物酶標記二抗孵育（1∶1 000）。本試驗采用β-actin做為內(nèi)參蛋白。最后進行X膠片曝光顯影。X膠片曝光顯影后，Image VCD gel imaging系統(tǒng)掃描蛋白條帶光密度值（OD），Hsp60蛋白表達情況用 Hsp60條帶OD值/β-actin條帶OD值表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行分析。并應(yīng)用Prism 5.0對試驗數(shù)據(jù)進行作圖。所有數(shù)值均表示為“Mean±SD”的形式。P＜0.05被認為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬暴露對肝臟Hsp60基因表達的影響（見圖1）

圖1 銅、鎘單一及聯(lián)合亞急性暴露對鯉肝臟Hsp60基因表達水平的影響

圖1結(jié)果表明，銅低濃度組Hsp60基因表達量在96 h內(nèi)均無明顯變化；銅高濃度組中，48 h后Hsp60基因表達量開始顯著升高（P＜0.05），在96 h時達到最高峰；鎘低濃度組中，24 h后Hsp60基因表達量顯著升高（P＜0.05），在96 h時達到頂點；鎘高濃度組與鎘低濃度組變化趨勢類似；混合低濃度組中，48 h后Hsp60基因表達量顯著升高（P＜0.05），96 h時變化不顯著（P＞0.05）；混合高濃度組中，48 h后Hsp60基因表達量顯著升高（P＜0.05），在96 h時達到最大值。

2.2 重金屬暴露對鯉肝臟Hsp60蛋白水平的影響（見圖2、圖3）

結(jié)果表明，銅低濃度組中，24 h時Hsp60蛋白水平顯著低于正常水平（P＜0.05），并隨時間緩慢呈緩慢上升趨勢，96 h時達最高點，但仍低于對照組水平；銅高濃度組中，Hsp60蛋白水平均低于對照組水平，96 h時接近對照組水平；鎘低、鎘高濃度組與銅高濃度組變化趨勢類似；混合低濃度組中，Hsp60蛋白水平均高于對照組水平，96 h時顯著升高（P＜0.05）；混合高濃度組與低濃度組類似。

圖2 銅、鎘單一及聯(lián)合亞急性暴露對鯉肝臟Hsp60蛋白水平的影響

圖3 肝臟中Hsp60 Western blot檢測結(jié)果

3 討論

3.1 重金屬暴露對鯉肝臟Hsp60基因表達的影響

本研究結(jié)果表明，除了銅低濃度組，其余所有處理組鯉肝臟Hsp60基因表達水平相比于對照組均有不同程度提高，并隨時間逐漸升高，在96 h達到最大值。這說明銅、鎘及二者混合物的亞急性暴露對鯉產(chǎn)生毒性作用，并導(dǎo)致肝臟中Hsp60基因表達水平升高。劉海超等[12]研究發(fā)現(xiàn)，銅暴露后48 h Hsp60 mRNA表達水平顯著上調(diào)，約為對照組的3.4倍，并隨著時間的延長在暴露96 h顯著上調(diào)并達到峰值，約為對照組的14.6倍。我們的試驗獲得了類似的結(jié)果，同時也印證了肝臟Hsp60對銅的誘導(dǎo)較為敏感。但我們的試驗結(jié)果中96 h峰值較低，不同物種、不同條件下Hsp表達的差異性可能是其原因[13]，同時鯉耐受力較強也可能導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生。由結(jié)果中可以看出，鎘處理組Hsp60基因表達水平升高顯著，這表明鎘暴露同樣誘導(dǎo)了鯉肝臟中Hsp60基因的過表達。銅、鎘聯(lián)合暴露組中，低濃度組Hsp60基因表達水平升高不顯著，而高濃度組顯著提高，這說明兩種重金屬聯(lián)合暴露對鯉的毒性作用不同于單一重金屬暴露，鯉機體對這兩種金屬脅迫的應(yīng)答可能既存在相加作用，又存在拮抗作用，確切的機制仍需要進一步研究。

3.2 重金屬暴露對鯉肝臟Hsp60蛋白水平的影響

由Western blot分析結(jié)果可以看出，兩種重金屬的急性暴露，導(dǎo)致短期內(nèi)鯉肝臟Hsp60蛋白水平低于對照組水平，這同之前報道的唐魚中Hsp70蛋白表達模式一致[14]。正常情況下，細菌和真核生物中，蛋白水平同相應(yīng)的mRNA水平密切相關(guān)[15]。相反地，有研究發(fā)現(xiàn)當機體處于應(yīng)激狀態(tài)時，會出現(xiàn)基因表達水平與蛋白水平不一致的現(xiàn)象[16]。Quirós等[17]研究發(fā)現(xiàn)，馬鲅（Barbusgraellsii）肝臟中金屬硫因蛋白水平同相應(yīng)的基因表達沒有明顯的相關(guān)性(P＞0.05)。我們的結(jié)果與其相似，這可能是重金屬暴露造成Hsp損傷，或者Hsp用于修復(fù)受損蛋白而產(chǎn)生消耗，同時也體現(xiàn)了Hsp作為分子伴侶的功能。在暴露后期，Hsp60蛋白水平均有不同程度升高，混合暴露組顯著高于對照組（P＜0.05），這表明機體處于環(huán)境脅迫狀態(tài)，需要大量的Hsp60來維持機體穩(wěn)態(tài)，體現(xiàn)了Hsp作為生化標記物的功能。

4 結(jié)論

①銅、鎘單一及聯(lián)合亞急性暴露對鯉產(chǎn)生毒性作用，在除了混合低濃度組的其他處理組中，鯉肝臟中Hsp60基因表達水平均有顯著升高（P＜0.05）。

②受銅、鎘單一及聯(lián)合亞急性暴露的影響，隨著暴露時間的延長，鯉肝臟中Hsp60蛋白水平從低于對照組水平開始逐漸上升，并達到或超過對照組水平，96 h時混合低濃度組顯著高于對照組（P＜0.05）。基因表達水平與相應(yīng)蛋白水平不一致的現(xiàn)象確實存在，確切機制仍需進一步研究。