■周小玲 舒 燕 周映華，2 胡新旭，2 高書鋒，2 王升平，2 曾發(fā)嬌 繆 東 劉惠知 張德元

（1.湖南省微生物研究院，湖南長沙 410009；2.飼用微生態(tài)制劑湖南省工程試驗室，湖南長沙 410009）

固態(tài)發(fā)酵是在一定濕度的固態(tài)基質(zhì)中，利用一種 或多種微生物進行的一個生物反應(yīng)過程，因其操作簡便、發(fā)酵過程比較容易控制而受到規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用的青睞?；炀腆w發(fā)酵是采用多種微生物進行的固體發(fā)酵，與單菌種發(fā)酵相比，發(fā)酵菌種之間可互相取長補短，將各菌優(yōu)勢發(fā)揮到最大?；炀l(fā)酵常用的菌種有霉菌、酵母菌、乳酸菌等。酵母菌固體發(fā)酵產(chǎn)物富含蛋白質(zhì)和多種酶，且具有特殊香味，適口性較好。而乳酸菌是一類能以糖為原料，發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸等有機酸的微生物，它是正常人畜腸道中非常重要的菌群，能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量的乳酸，抑制有害細菌生長，具有維持腸道菌群的微生態(tài)平衡，增強機體免疫功能，提高飼料利用率等功能，被廣泛用于微生態(tài)制劑。本研究利用發(fā)酵袋，選用副干酪乳桿菌、釀酒酵母及枯草芽孢桿菌進行復(fù)合微生物固體發(fā)酵，研究三菌復(fù)合固體發(fā)酵后含菌數(shù)、營養(yǎng)成分等的變化規(guī)律，為復(fù)合菌固體發(fā)酵規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtili)、釀酒酵母（Sac?charomyces cerevisiae）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）均由本實驗室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB∶蛋白胨10 g/l、牛肉膏3 g/l、NaCl 5 g/l，pH值7.2，121℃滅菌30 min備用；

土豆葡萄糖培養(yǎng)基：土豆20%、葡萄糖2%，pH值自然，121℃滅菌30 min備用；

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏8 g/l、酵母膏4 g/l、葡萄糖 20 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、MnSO4·H2O 0.03 g/l、吐溫-80 1 ml/l，pH值自然，121 ℃滅菌20 min備用。

麥康凱瓊脂、SS瓊脂購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，按照說明書進行配制使用。

1.3 主要試驗儀器設(shè)備

超凈工作臺、高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、pH計、紫外可見分光光度計、搖床等。

2 試驗方法

2.1 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及副干酪乳桿菌發(fā)酵液的制備

取枯草芽孢桿菌單菌落接種LB斜面，于30℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)活化，待枯草芽孢桿菌斜面長好，用接種環(huán)刮取兩環(huán)菌苔轉(zhuǎn)入裝有100 ml LB三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)18～24 h備用；將4℃保存條件下釀酒酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 ml土豆葡萄糖培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃搖床振蕩培養(yǎng)28～30 h備用；副干酪乳桿菌活化，取冷凍保存副干酪乳桿菌復(fù)活，轉(zhuǎn)接到裝有100 ml MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h備用。

2.2 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母及副干酪乳桿菌混菌發(fā)酵工藝

將制備好的枯草芽孢桿菌、副干酪乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵液按1∶1∶1混合，發(fā)酵液接種比例3%（按照全部成分計算），與水混勻后（菌液和水含量合計40%），加入全價乳豬配合粉料（不添加抗生素，固態(tài)料比例為60%）中混合均勻，裝袋密封，室溫存放。每隔一定時間取樣，測定發(fā)酵產(chǎn)物pH值及其中枯草芽孢桿菌、副干酪乳桿菌和釀酒酵母含量；測定粗蛋白、粗纖維及小肽含量；測定發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸（乳酸、乙酸、檸檬酸）及酶（蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、植酸酶）含量；檢測發(fā)酵飼料中有害微生物——大腸桿菌、沙門氏菌數(shù)量。

2.3 測定方法

枯草芽孢桿菌含菌數(shù)：LB平板計數(shù)法；副干酪乳桿菌含菌數(shù)：MRS平板計數(shù)法；酵母菌含菌數(shù)：土豆葡萄糖平板計數(shù)法；大腸桿菌含菌數(shù)：麥康凱平板計數(shù)；沙門氏菌含菌數(shù)：SS瓊脂平板計數(shù)法。

總Ca含量：參照GB/T 6436—2002飼料中鈣的測定；總P含量：參照GB/T6437—2002飼料中總磷分光光度法測定；pH值：pH計法；粗蛋白含量：參照GB/T 6432—1994飼料中粗蛋白測定方法測定；粗纖維含量：參照GB/T 6434—2006飼料中粗纖維測定方法；小肽含量：考馬斯亮藍法；乳酸、檸檬酸、乙酸：液相色譜法測定，乳酸、檸檬酸色譜條件：流動相，乙腈∶0.1%磷酸溶液=1∶39，流速1.0 ml/min，檢測波長210 nm，進樣量20 μl，乙酸色譜條件：流動相，0.002 0 mol/l H2SO4溶液，流速 1.0 ml/min，檢測波長2.6 min前210 nm，2.6 min后300 nm，進樣量10 μl；蛋白酶：參照 GB/T 23527—2009 測定；纖維素酶：參照NY/T 912—2004飼料添加劑纖維素酶活力的測定分光光度法進行；淀粉酶：參照GB/T 5521—2008進行；植酸酶：參照GB/T 18634—2009分光光度計法進行。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)合菌固體發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌、副干酪乳桿菌、釀酒酵母含菌數(shù)的變化(見圖1～圖3)

圖1 不同發(fā)酵時間副干酪乳桿菌含菌數(shù)變化（發(fā)酵飼料濕基計算）

圖2 不同發(fā)酵時間釀酒酵母含菌數(shù)變化(發(fā)酵飼料濕基計算)

圖3 不同發(fā)酵時間枯草芽孢桿菌含菌數(shù)變化（發(fā)酵飼料濕基計算）

隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵飼料中副干酪乳桿菌含菌數(shù)顯著增加，在發(fā)酵第5～10 d含菌數(shù)最高（如圖1），達3.6×109cfu/g，后隨著發(fā)酵時間延長，副干酪乳桿菌含菌數(shù)逐漸下降；飼料中釀酒酵母在發(fā)酵第5 d含菌數(shù)最高，5 d后隨著發(fā)酵時間的延長含菌數(shù)降低，隨著副干酪乳桿菌的大量繁殖，發(fā)酵飼料中有機酸的產(chǎn)生，pH值下降，在發(fā)酵31 d后基本檢測不到釀酒酵母活菌（如圖2）；枯草芽孢桿菌在發(fā)酵第5 d略有增加，由于枯草芽孢桿菌雖然可以形成抗逆性強的芽孢，但生長還是受到了一定影響，在發(fā)酵10 d后開始下降（如圖3）。

3.2 復(fù)合菌固體發(fā)酵過程中粗蛋白等營養(yǎng)成分含量的動態(tài)變化（見圖4～圖5）

圖4 不同發(fā)酵時間粗蛋白含量變化（發(fā)酵飼料濕基計算）

圖5 不同發(fā)酵時間小肽、粗纖維、總鈣、總磷含量變化（發(fā)酵飼料濕基計算）

隨著時間延長，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白有增加趨勢（如圖4），而發(fā)酵飼料中總鈣質(zhì)和總磷含量一直保持穩(wěn)定水平，小肽含量隨著發(fā)酵時間延長略有增加，而其中粗纖維在發(fā)酵前期略有降低（如圖5）。

3.3 復(fù)合菌固體發(fā)酵過程中有機酸含量的動態(tài)變化

隨著發(fā)酵時間延長，乳酸菌的大量繁殖，產(chǎn)生了大量有機酸，乳酸在發(fā)酵第31 d時含量達到最高值(1 395.9 μg/g)，此后略有下降，而乙酸和檸檬酸均在發(fā)酵第75 d時達到最高值，分別為978.7 μg/g和1 157.8 μg/g，3種有機酸均保持在一定水平（如圖6）。因乳酸菌的大量繁殖，有機酸的不斷產(chǎn)生，發(fā)酵產(chǎn)物pH值自發(fā)酵開始后下降，在第10 d達到4.32，此后穩(wěn)定在此水平（如圖7）。

圖6 不同發(fā)酵時間有機酸含量變化（發(fā)酵飼料濕基計算）

圖7 不同發(fā)酵時間pH值變化

3.4 復(fù)合菌固體發(fā)酵過程中蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、植酸酶含量的動態(tài)變化

在發(fā)酵第10 d開始檢出蛋白酶，在發(fā)酵一個月時達到最高，為125.4 U/g，隨后隨著含菌數(shù)開始下降，蛋白酶含量下降，到發(fā)酵75 d時已檢測不到，纖維素酶先上升后下降，在發(fā)酵1個月后檢測不到（如圖8），而發(fā)酵過程中始終未檢出淀粉酶和植酸酶。

圖8 不同發(fā)酵時間酶含量變化（發(fā)酵飼料濕基計算）

3.5 復(fù)合菌固體發(fā)酵過程中大腸桿菌、沙門氏菌的動態(tài)變化

對發(fā)酵過程中有害菌進行了檢測，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌隨著發(fā)酵時間延長而下降，發(fā)酵1個月后檢測不到大腸桿菌，而沙門氏菌始終未被檢出?？赡苁请S著副干酪乳桿菌的大量生長，有機酸的產(chǎn)生，pH值降低，對有害細菌生長產(chǎn)生抑制，使得飼料中大腸桿菌大大降低，最后檢測不到（如圖9）。

圖9 不同發(fā)酵時間有害菌含量變化（發(fā)酵飼料濕基計算）

4 討論

與液體發(fā)酵相比，固體發(fā)酵有著許多優(yōu)點，如簡單的生產(chǎn)工藝,同時在發(fā)酵生產(chǎn)過程無廢水、廢氣等廢棄物的產(chǎn)生,成本低、能耗少，且環(huán)保等。而全價發(fā)酵飼料是將微生物和水一起加到全價無抗配合飼料中，在適當(dāng)溫度下發(fā)酵而成。該飼料可滿足動物營養(yǎng)需要，同時富含多種有機酸、維生素和益生菌。不但可以有效地節(jié)約成本，還能促進動物生長、增強動物疾病抵抗力等。

目前應(yīng)用于固體混合發(fā)酵菌種組合主要為霉菌與酵母菌組合、乳酸菌與芽孢桿菌組合、芽孢桿菌與酵母菌組合等，應(yīng)用乳酸菌、酵母菌及芽孢桿菌組合固體混合發(fā)酵研究較少。本研究采用副干酪乳桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌進行三菌復(fù)合固體發(fā)酵全價飼料，發(fā)酵在密封的帶呼吸膜的發(fā)酵袋中進行。因發(fā)酵是在密封的發(fā)酵袋中進行，而釀酒酵母和枯草芽孢桿菌為需氧菌，發(fā)酵開始，釀酒酵母和枯草芽孢桿菌生長將發(fā)酵袋中氧氣消耗完，提供了厭氧環(huán)境，有利于副干酪乳桿菌的生長。在整個發(fā)酵過程中，副干酪乳桿菌生長處于優(yōu)勢，同時產(chǎn)生大量乳酸、乙酸等有機酸，使發(fā)酵物料pH值維持在較低水平，隨著發(fā)酵時間的延長，在發(fā)酵31 d后沒有檢測到酵母活菌；而枯草芽孢桿菌由于雖然可以形成抗逆性強的芽孢，但生長還是受到了一定影響，在發(fā)酵10 d后開始下降。

應(yīng)用副干酪乳桿菌進行混合固體發(fā)酵飼料方面的研究也較少，主要集中在干酪乳桿菌的研究。張軍等(2011)采用干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌以麩皮等為基質(zhì)進行固態(tài)混合發(fā)酵，4 d后活菌數(shù)達3×109cfu/g，本研究三菌固態(tài)發(fā)酵后副干酪乳桿菌活菌數(shù)在發(fā)酵10 d后達3.6×109cfu/g，固體發(fā)酵水平相當(dāng)。一般來說活菌數(shù)是影響益生菌益生效果的主要因素，一般要求每克要達到108個菌體才有效。本研究中一直到發(fā)酵60 d，副干酪乳桿菌含量均在1.01×108cfu/g以上。馬治宇（2008）、徐基利等（2010）研究表明，乳酸菌菌粉能夠顯著抑制大腸埃希菌的繁殖，本次試驗過程中隨著發(fā)酵時間的延長，全價配合飼料中有害菌大腸桿菌下降，最后檢測不到。

在整個全價料混菌固體發(fā)酵過程中粗蛋白和小肽含量略有上升，而粗纖維含量未有明顯下降，表明副干酪乳桿菌、釀酒酵母及枯草芽孢桿菌三菌組合對粗纖維降解能力較差。復(fù)合益生菌固態(tài)混合發(fā)酵的菌種配比及其益生作用機理還有待進一步的研究。

5 結(jié)論

本試驗研究表明，可以用副干酪乳桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌對無抗全價豬料進行三菌復(fù)合固體發(fā)酵，可以適當(dāng)增加發(fā)酵后飼料中粗蛋白和小肽含量，顯著降低pH值，提高乳酸菌含量，降低有害菌大腸桿菌含量，發(fā)酵效果以5～10 d最優(yōu)。

（參考文獻若干篇，刊略，需者可函索）